血清microRNA-155水平在乳腺癌早期诊断和预后评价中的作用

张 超，童富云△，胡 滢

(1.重庆市涪陵中心医院乳腺甲状腺血管外科，重庆 408000；2.陆军军医大学第一附属医院乳腺甲状腺外科，重庆 400038)

乳腺癌是严重威胁女性健康的恶性肿瘤，其发病率在我国呈逐年上升趋势[1]。随着手术，放、化疗技术的飞速发展及多模态成像设备的应用，治疗乳腺癌的疗效得到了极大的改善。然而，乳腺癌的转移与复发仍不能得到有效的控制，是乳腺癌患者致死的主要原因[2]。早期诊断乳腺癌并根据预后预测指导全程最佳治疗达到减少复发、转移的目的具有重要的研究意义。在乳腺癌早期诊断的标志物中微小RNA(microRNA)正受到越来越多的关注[3-6]。近期有研究表明，microRNA-155的过度表达与肿瘤的侵袭与转移密切相关，其机制主要包括促进肿瘤细胞上皮-间质转化、抑制细胞凋亡等[7-9]。患者血清microRNA-155水平与临床病理的关系及其对诊断与预后预测的作用已成为目前的研究热点。本研究通过回顾性分析乳腺癌患者与健康女性血清microRNA-155水平，研究其在乳腺癌早期诊断与预后评价中的意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2012年9月至2013年12月重庆市涪陵中心医院经病理检查诊断为乳腺癌的81例女性患者的外周血样本及相对应的病理切片作为研究组。乳腺癌病理诊断标准采用WHO乳腺肿瘤的病理分型，入组患者均为美国国立综合癌症网络(NCCN)乳腺癌临床实践指南临床分期为Ⅰ～Ⅲ期的患者，且尚未开始接受手术等其他治疗。收集同期在重庆市涪陵中心医院健康体检的80例健康女性的外周血样本作为对照组。对照组均为成年、非妊娠、无严重心肺疾病的健康女性。乳腺癌组患者年龄35～75岁，平均(51.26±6.99)岁；对照组健康女性年龄29～76岁，平均(50.87±7.52)岁。两组研究对象年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)。本研究已获得该院伦理委员会批准，同时，经患者或亲属授权并签署本研究知情同意书。

1.2方法

1.2.1提取总RNA 采集两组研究对象血液标本5 mL于乙二胺四乙酸二钾抗凝管中，静置30 min，然后4 000 r/min(离心半径20 cm)离心25 min，将上清液转移至无RNA酶的Eppendorf离心管中，每管200 μL，根据RNA提取试剂盒(上海生工生物工程有限公司)说明书的要求，采用Trizol法提取RNA。

1.2.2microRNA的逆转录 采用microRNA q聚合酶链反应(PCR)试剂盒(南京凯基生物有限公司)进行逆转录。具体反应体系为包括50 ng/μL的模板RNA，25 U/μL的Poly A聚合酶1 μL，RTase Mix 1μL,PAP/RT缓冲液10 μL，使用焦碳酸二乙酯(DEPC)水将体系调整至30 μL。PCR反应程序设置为37 ℃ 60 min、70 ℃ 15 min。克隆用PCR引物(苏州金维智科技有限公司)：上游引物3′-GGATCCGGTGGCACAAACCAGGAA-5′；下游引物5′-GAATTCTCTAAGTTTATCCAGCAGGGTG-3′。

1.2.3实时定量PCR检测microRNA 采用实时定量荧光PCR的方法检测样本中microRNA-155的表达水平。具体反应体系包括10 μL的2×Mix 、2 μL通用引物、2 μL特异引物、2 μL cDNA等，然后使用无RNA酶的双蒸水将体系调整为25 μL。PCR反应条件为95 ℃ 10 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，循环数(Ct)为50。

1.2.4计算microRNA相对表达量 使用U6内参基因对目标基因进行均一化。通过Ct值计算microRNA-155相对表达水平，即荧光PCR信号达到预设阈值所需要的Ct。ΔΔCt可计算目标基因的相对表达。ΔCT样本=CT样本-CT内参;ΔCT对照=CT对照-CT内参;ΔΔCT=ΔCT样本=ΔCT对照。

2 结 果

2.1两组研究对象血清microRNA-155表达水平比较 乳腺癌组患者血清microRNA-155表达水平明显高于对照组，是对照组的3.5倍，差异有统计学意义(t=8.71,P=0.001)。见表1。

表1 两组研究对象血清microRNA-155相对 表达水平比较

2.2microRNA-155表达水平与乳腺癌患者临床病理特征的关系 microRNA-155表达水平与淋巴结转移具有显著的相关性,有淋巴结转移患者microRNA-155表达水平明显高于无淋巴结转移者，差异有统计学意义(P<0.05)。然而，microRNA-155表达水平与患者年龄、肿瘤分期、肿瘤直径、雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)等无关，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 microRNA-155表达水平与乳腺癌患者临床 病理特征的关系(n=81)

图1 microRNA-155表达的ROC曲线

2.3microRNA-155表达水平在乳腺癌中的诊断价值 血清microRNA-155水平诊断乳腺癌的ROC曲线下面积为0.941(95%可信区间：0.899～0.982)，临界值为1.165，灵敏度、特异度分别为84.2%和91.3%。microRNA-155表达水平对乳腺癌具有较高的诊断价值。见图1。

2.4microRNA-155表达水平在乳腺癌预后评价中的价值 以microRNA-155表达的中位数2.49将研究组或者分为小于2.49组(40例)和大于或等于2.49组(41例)。两组患者生存率比较，差异有统计学意义(χ2=4.811，P=0.027)。见图2。

图2 两组患者生存率比较

3 讨 论

乳腺癌治疗的关键在于早期诊断与干预，因此，发现新的易于检测且具有一定灵敏度和预后预测作用的早期诊断分子标志物具有极大的临床意义，从健康人群中筛查、鉴别出早期乳腺癌患者，进而提高乳腺癌早期诊断的效率，并尽早开始综合治疗，达到提高疗效的目的。

microRNA是参与基因转录后水平调控的一类非编码RNA，国内外研究均表明，其在肿瘤发生、发展中具有重要作用[10-12]。microRNA-155是一种多功能microRNA，血循环中主要来自于细胞，因血循环中其多与蛋白相结合，稳定性好，故是作为肿瘤标志物研究的基础。

本研究比较了乳腺癌患者和健康者血清microRNA-155的表达水平，结果显示，乳腺癌患者血清microRNA-155表达水平明显高于健康女性，差异有统计学意义(P<0.05)，与相关研究结果一致[13]，即microRNA-155在乳腺癌患者血清中的表达显著升高。本研究通过制作ROC曲线发现，检测血清microRNA-155表达水平对乳腺癌具有较高的诊断价值，ROC曲线下面积为0.941，灵敏度、特异度分别为84.2%和91.3%，与国外相关研究结果相符[14-15]。

尽管钼靶检查等常规筛查手段在目前乳腺癌诊断中具有重要地位，但已有研究表明，microRNA-155诊断乳腺癌的诊断价值比钼靶更高[16]。钼靶还因辐射、乳腺组织本身等因素的影响导致应用受限。而检测microRNA-155表达更易获取检测标本，对受试者基本无创伤和痛苦，操作方法成熟，是潜在的良好的诊断乳腺癌的标志物。

本研究结果显示，血清microRNA-155的表达水平与淋巴结转移显著相关，淋巴结转移组患者血清microRNA-155表达水平明显高于无淋巴结转移组，而与患者年龄、是否绝经、激素受体等临床病理特点无关，与相关研究结果基本一致[17]。表明microRNA-155的高表达可能导致淋巴结转移，而转移正是乳腺癌患者致死的主要原因。本研究Kaplan-Meier生存分析结果显示，不同microRNA-155表达水平组患者生存率比较，差异有统计学意义(P<0.05)，microRNA-155高表达提示预后较差，原因可能是microRNA-155通过调控促进上皮-间质转化从而加快肿瘤转移的进程[18]。

4 结 论

microRNA-155的表达在乳腺癌的诊断与预后预测中具有重要意义,可能成为诊断乳腺癌并根据预后预测指导临床治疗的重要标志物。