新型猪蓝耳病基因工程活疫苗(PC株)的研究及应用

李文生，孙志勇，范 娟，宋庆庆

（金宇生物技术股份有限公司，内蒙古 呼和浩特 010030）

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS），又称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV）引起的一种高度传染性疾病，其主要临床特征表现为母猪繁殖障碍和仔猪、育肥猪的呼吸困难。自1987年在美国发现以来，该病已在全世界范围内流行。在美国，每年因PRRS造成的损失高达5.6亿～6.6亿美元[1-2]。我国自1996年证实了PRRS的存在以来，特别是发生于2006年春的“无名高热”（即高致病性猪蓝耳病），给我国养猪业造成了巨大的经济损失。

1 PRRSV的基本结构

PRRSV是有囊膜的单股正链RNA病毒，根据其基因组和抗原性的差异，可分为欧洲型（基因1型）和美洲型（基因2型）。虽然欧洲型和美洲型的基因序列的同源性在63%左右[3]，但二者具有几乎相同的基因组合方式和致病机理。PRRSV基因组包含至少10个开放阅读框（Open Reading Frames，ORFs），分别是 ORF1a，ORF1b和ORF2～ORF7，每个ORF编码的蛋白也各不相同（见表1和表2）[4]。

2 PRRSV中各蛋白的功能及在免疫学方面的作用

由于PRRSV的基因组相对复杂，其编码的非结构蛋白（Nonstructural protein，Nsp）和结构蛋白数量较多，每一种蛋白质在病毒感染、入侵细胞、病毒复制、诱导细胞凋亡、宿主免疫等方面各自发挥着不同的作用，下表是关于猪蓝耳病病毒蛋白结构及功能（表1和表2）[5-16]。

从以上信息可知，猪蓝耳病病毒无论是非结构蛋白或结构蛋白均可能存在免疫功能。而多数研究表明，非结构蛋白重要的作用是参与病毒复制、病毒侵入机制及病毒致病力等，即病毒毒力和致病力等问题可能主要取决于非结构蛋白，因此对非结构蛋白的研究近年来得到广泛关注。

3 我国猪蓝耳病疫苗现状

3.1 疫苗种类

目前国内用于猪蓝耳病预防接种的商品化疫苗主要有三大类，分别是减毒活疫苗、灭活苗和基因工程嵌合疫苗，具体疫苗类型及毒株详见表3。

3.2 传统猪蓝耳病疫苗临床应用的优劣

在养猪生产过程中，猪蓝耳病疫苗被关注的焦点主要是传统经典毒株和变异毒株之间是否具有很好的交叉保护力、变异毒株是否安全和稳定等问题。养殖生产者都迫切希望能对不同毒株的猪蓝耳病疫苗进行排名以区分优劣，甚至在猪场内进行PRRSV测序，期望找到与猪场内PRRSV基因序列同源性最高的疫苗毒株。

3.2.1 灭活疫苗

猪蓝耳病灭活苗具有高度安全的特点，相比于减毒活疫苗，可用于任何阶段猪群而不会出现临床发病的问题。但灭活苗也有其不足，主要表现在以下几个方面：1）免疫力不强，猪蓝耳病灭活苗能产生体液免疫，但几乎不产生细胞免疫，细胞免疫对猪只免疫保护起着重要作用；2）由于猪蓝耳病具有抗体依赖增强效应（ADE），且灭活苗仅有体液免疫作用，因此在抗体衰减过程中容易出现临床反弹的现象，因此要求猪只被高密度免疫；3）猪蓝耳病灭活苗对疫苗品质要求非常高，尤其对抗原含量要求高，因此高倍浓缩的疫苗才有一定效果，但疫苗成本居高不下。

表1 PRRSV结构蛋白主要功能

表2 PRRSV非结构蛋白主要功能

表3 国内猪蓝耳病商品化疫苗汇总

3.2.2 经典毒株减毒活疫苗

经典减毒活疫苗的优点是具有较好的安全性和较强的毒株稳定性，科学使用基本不造成明显的临床表现。但由于猪蓝耳病病毒的高度变异，导致20多年前分离的毒株其基因同源性与当前流行毒株的同源性相比较低，高变区同源性只有80%多。因此造成其免疫匹配度差，交叉免疫保护效果不佳。

3.2.3 传统高致病毒株减毒活疫苗

高致病毒株是最近10来年分离到的毒株，与当前流行田间株具有较高的同源性和不错的交叉免疫保护效果（NADC like株除外）。但相比于灭活疫苗和经典毒株减毒活疫苗，传统高致病株减毒活疫苗存在安全性问题，长时间使用可能造成母猪流产、返情及呼吸道症状等。

3.3 新型基因工程嵌合疫苗（PC株）的特点及临床应用效果

3.3.1 猪蓝耳病新型基因工程嵌合疫苗（PC株）基本构架

基因工程嵌合疫苗是近年才研发出的一种新型猪蓝耳病活疫苗，目前市面上仅一种毒株，即PC株。它是利用反向遗传技术，将猪蓝耳病病毒经典毒株（SP株）的ORF1a和ORF1b，以及猪蓝耳病病毒高致病性毒株（GD株）的ORF2～ORF7重组成嵌合病毒疫苗株（如图1）。

3.3.2 猪蓝耳病新型基因工程嵌合疫苗（PC株）的特点

由于基因工程嵌合疫苗（PC株）结合了猪蓝耳病病毒经典毒株和高致病性毒株的部分基因，因此该疫苗具有以下几个其他种类疫苗不可比拟的优点：1）交叉保护。利用基因工程改造的疫苗，免疫原性好，既能预防经典猪蓝耳病毒株，又能预防高致病变异猪蓝耳病毒株，解决了实际生产过程中猪蓝耳病疫苗选择难的问题。2）安全性高。相比于传统减毒弱毒活疫苗，它的安全性更高，注射后猪只无体温反应，排毒时间短，妊娠母猪、仔猪均可使用。3）稳定性强。该毒株遗传稳定，不变异，不易与其他PRRSV毒株发生田间重组。4）易于鉴别。由于疫苗毒株在基因改造过程中加入了特殊的标记序列，可与其他疫苗株区分，还可识别野毒株。既能用于鉴别诊断，又利于猪群蓝耳病的净化。

3.3.3 基因工程嵌合疫苗（PC株）的临床应用

3.3.3.1 攻毒保护实验

图1 猪蓝耳病疫苗（PC株）基因结构示意图

作为一种全新的基因工程嵌合疫苗，猪蓝耳病疫苗（PC株）能给猪群提供坚强的保护力。试验仔猪于4周龄分别免疫不同公司的猪蓝耳病疫苗后，在62日龄进行攻毒试验（毒株：JXA1）。结果显示：攻毒后，所有试验组猪只的体温都经历了先升高后下降的变化趋势，但猪蓝耳病嵌合疫苗（PC株）组猪只的体温在攻毒后第9天时即基本恢复到正常水平，而其他实验组猪只的体温恢复时间明显延后（见图2）。

猪在感染猪蓝耳病病毒后的一段时间内都会向外界环境中排毒，猪对病毒的抵抗力越强，其排毒时间就越短。攻毒试验结果显示，所有实验组的猪只在攻毒后第3天都出现了明显的排毒现象，但在攻毒后第7天，猪蓝耳病嵌合疫苗（PC株）组的排毒比例明显下降，第15天时便不再排毒；而免疫了其他种类猪蓝耳病疫苗组的猪只排毒比例会出现反弹（见图3）。以上结果说明，猪蓝耳病疫苗（PC株）能明显缩短猪只的排毒时间，降低排毒猪比例，为猪只提供坚强的保护力。

不同种类疫苗的免疫保护力也不尽相同。免疫了猪蓝耳病疫苗（PC株）的仔猪，在攻毒后18 d都没有出现死亡的个体，且健康状况良好。免疫了猪蓝耳病疫苗（经典株）的仔猪存活率为80%，说明它对仔猪只提供了部分保护力。而攻毒对照组在攻毒后18 d的仔猪存活率仅为40%，明显低于3个疫苗免疫组（见图 4）。

3.3.3.2 疫苗安全性对比实验

通过比较不同毒株的猪蓝耳病疫苗试验发现，给21日龄健康仔猪免疫猪蓝耳病疫苗（JXA1-R株）1头份，在免疫后第14天进行剖检，可以见到仔猪肺脏发生了病变（见图5）、腹股沟淋巴结出血，呈大理石样（见图7）。而相同试验条件下，免疫了猪蓝耳病疫苗（PC株）的仔猪，在免疫后第14天的剖检结果显示均没有出现明显病变（见图6和图8），表明猪蓝耳病疫苗（PC株）具有很高的安全性，不会对免疫猪只的脏器、免疫器官等造成损害。

4 结论

通过各种临床应用数据发现，新型嵌合疫苗（PC株）不仅能提供更好的免疫保护效果，同时疫苗本身也更加安全，是解决当前猪蓝耳病防控难的好选择。当然，任何一种疫苗都需要经过大量和长时间临床应用的考验，方能证明其毒株稳定性和安全性的问题，因此笔者将长期追踪该疫苗毒株在临床长期传代后对猪群的致病性及毒株变异情况。

图2 不同疫苗免疫的仔猪攻毒后体温变化

图3 不同疫苗免疫的仔猪攻毒后排毒时间

图4 不同疫苗免疫的仔猪攻毒后存活率

图5 JXA1-R株疫苗免疫仔猪后肺脏病变

图6 PC株疫苗免疫仔猪后肺部正常

图7 JXA1-R株疫苗免疫仔猪后淋巴结病变

图8 PC株疫苗免疫仔猪后扁桃体与淋巴结

猪蓝耳病基因工程嵌合疫苗（PC株）结合了市面上猪蓝耳病弱毒活疫苗和灭活疫苗的优点，规避了二者的缺点，不仅能刺激机体产生体液免疫应答，而且能够激发较强的细胞免疫应答。相信在未来，无论养殖场的猪蓝耳病感染情况如何，建立完善的生物安全防控体系，做好猪蓝耳病免疫工作，只要坚持不懈，一定会降低猪蓝耳病的临床感染率和发病率，并逐步达到净化的目的。