HNRNPA1 在小肝癌补救性肝移植中的临床意义

杨和君，柯瑞盛，江哲龙，张小进，蔡秋程，沈佳佳，潘凡，张坤， 江艺，吕立志（.中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院肝胆外科，福建 福州 35005；.厦门大学附属第一医院普外科，福建 厦门 36003）

原发性肝癌（hepatocellular carcinoma， HCC）是常见的恶性肿瘤之一，即小肝癌（直径≤5 cm）， 肝癌切除术后总体治疗效果也欠佳［1］。肝移植是目前肝癌最有效的根治性手段［2］。但由于供肝短缺的现状，Majno 等［3］提出针对小肝癌治疗的补救性肝移植（salvage liver transplantation，SLT）概念，即对肝功能良好符合“米兰标准”的HCC，首先采取肝癌切除治疗，术后肝癌肝内复发（标准同上）或出现肝功能衰竭时再行肝移植的治疗策略。寻找与HCC 肝移植术后肿瘤复发相关的生物学指标，对制定肝癌肝移植的手术适应证和改善患者预后具有重要的临床意义［4］。研究发现剪接因子是癌症发展中的重要参与者［5］。HNRNPA1 是其中的一种剪接因子，近年来对于HNRNPA1 参与肿瘤的进展常有报道［6］。目前对HNRNPA1 在小肝癌补救性肝移植肝癌组织中表达情况及其预后关系尚未清楚。本研究中实验验证结合生物信息学分析HNRNPA1 表达与补救性肝移植患者预后的意义，并用GSEA 基因富集分析HNRNPA1 表达可能涉及到的生物学过程。

1 资料与方法

1.1 一般资料：收集2013 年1 月— 2016 年1 月第九〇〇医院肝胆外科接受小肝癌切除术，肝癌复发后又行补救性肝移植手术治疗12 例患者的前后两次肝癌组织（-80℃冻存），运用qRT-PCR 法检测肝癌组织中HNRNPA1 蛋白表达是否存在变化。 回顾性分析2005 年1 月—2013 年12 月在本中心 因肝癌复发施行同种异体经典原位肝移植且经病 理证实的肝癌组织标本，免疫组织化学法检测其 表达。所有入组患者研究前均获得患者本人和家属的知情同意，并获得第九〇〇医院伦理委员会批 准（2013-003）。入组患者均符合“米兰标准”的肝癌肝移植患者，移植前曾行肝肿瘤切除术，并排除临床资料保存不完整及术后3 个月内死于并发症的患者。共收集满足以上条件的病例68 例。患者手术方式及移植术后治疗方案和随访方法，均与本中心既往报道相类似［7］。

1.2 实验方法及试剂

1.2.1 主要试剂：Trizol 试剂、Real-time PCR SYBR Green 试 剂 盒、逆 转 录 试 剂 盒（Aidlab 公 司）。 寡聚核苷酸引物：内参β-actin、目的基因 HNRNPA1 均由上海英骏公司设计合成，引物 序列如下：HNRNPA1：5‘- TTTGACGACCATGACT CCGT-3’（forward）和 5‘- CACGACCACCACCAAA GTTT-3（reverse）；β-actin：5’-AGCGAGCA TCCCCCAAAGTT-3’（forward）和5’-GGGCACGAA GGCTCATCATT-3’（reverse）。抗鼠抗人HNRNPA1单克隆抗体（英国Abcam 公司），辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG 多聚体试剂盒，二氨基联苯胺（DAB）显色剂（福州迈新公司）。

1.2.2 取-80 ℃冰箱中保存的新鲜冰冻组织，按Trizol 试剂说明书，提取组织的RNA，使用Nanodrop 测定RNA 的纯度（OD260／OD280）和浓度。取1μg Total RNA，应用TaKaRa 逆转录试剂盒合成cDNA 的第一链，TaKaRa 公司 SYBR Green 试剂盒，按照说明书冰上加样，实验设置阴性对照用双蒸水代替模板，以β-actin 作对照，检测HNRNPA1 基因的表达情况，基因定量经ABI7900 荧光定量PCR 仪检测，反应条件设置为预变性 95 ℃30 s，PCR 反应94℃ 4 min；94℃ 30 s， 56℃ 30 s，72℃ 25 s，30 个循环；溶解曲线条件：50 ℃ 2 min， 95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s， 40 个循环；降温 50 ℃ 30 s。用2-△△Ct值表示HNRNPA1 表达在肝癌组织中的表达量。

1.2.3 免疫组织化学法：将石蜡包埋的组织标本连续切成厚度为4 μm 的薄片，60 ℃烤片，二甲苯脱蜡15 min，依次浸泡在无水乙醇、90%乙醇、85%乙醇中各3 min，再浸泡于新鲜配制的3%过氧化氢溶液15 min，消除内源性过氧化物酶活性。置于1 ∶50 乙二胺四乙酸溶液中95 ℃下行微波抗原热修复15 min，磷酸盐缓冲液（PBS） 处理20 min 后，用4%胎牛血清封闭液37 ℃下孵育30 min，然后滴加PBS 稀释的HNRNPA1 抗体（1 ∶100），37 ℃ 下孵育30 min，4 ℃过夜。用辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG 多聚体试剂盒对组织切片进行二级免疫反应，滴加新鲜配置的二氨基联苯胺显色剂后， 显微镜下控制反应颜色，流水冲洗6 min，苏木素复染30 s，流水冲洗10 min，60 ℃烤箱内烘干后中性树脂封片。阳性表达以细胞核和／或细胞浆内出现棕黄色颗粒为准。结果采用Greenspan 半定量 法［8］，评分≤3 为阴性，＞3 分为阳性。

1.4 统计学方法：采用SPSS 22.0 进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，计数资料采用率表示。计数资料的组间比较采用卡方检验和Fisher 确切概率法。生存曲线以Kaplan-Meier 法完成并以Log-Rank 检验。采用Cox 回归模型分别进行单因素和多因素分析。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 随访结果：本研究所有68 例患者均完成随访，随访截止至2017 年5 月30 日，其中男性65 例， 女性3 例，中位年龄为49（22 ～73）岁，肿瘤平均直径为2.9 （0.6 ～ 5.0）cm；5 年总累积生存率为27.94%（19 例），随访期间无复发34 例（50%），生存期随访中位时间为50（11 ～125）个月； 共复发或转移34 例（50%），复发或转移时间为术后 2 ～55 个月。

2.2 小肝癌组织中HNRNPA1 的表达：肝癌组织qRT-PCR 结果显示，12 例肝癌患者两次手术的肝癌组织及癌旁组织（n=24）mRNA 表达水平存在差异（P ＜0.001，图1A）。12 例患者的肝切除癌组织与相应肝移植癌组织比较HNRNPA1 蛋白表达，差异无统计学意义（P=0.618，图1B）， 提示同一患者前后两次手术的肝癌组织中HNRNPA1 蛋白表达变化不存在明显差异。免疫组化实验结果：HNRNPA1 蛋白表达主要在细胞核，部分位于细胞浆（图1C 和D）。68 例补救性肝移植患者的肝癌组织中HNRNPA1 阳性表达42 例（61.76%），癌旁组织中阳性表达13 例（19.12%），两者比较差异有统计学意义。Kaplan-Meier 分析显示肝癌组织HNRNPA1 高表达与患者肝移植术后累积复发率及累积生存率的关系有统计学意义（P ＜0.001，见图1E 和F）。

2.3 HNRNPA1 表达与患者临床病理学参数的关系：HNRNPA1 表达与患者的肿瘤包膜、血管侵犯、肿瘤复发相关（P ＜0.05），结果详见表1。

2.4 HNRNPA1 表达与肝移植患者预后的关系： 肝癌肝移植患者的1、3、5 年累积复发率及累积生存率见表2。COX 多因素分析显示患者累计生存率与HNRNPA1 高表达（P=0.002，HR=3.381，95% CI=1.561 ～7.320）、血管侵犯（P=0.020， HR=2.278，95% CI=1.138 ～4.559）密切相关； COX 多因素分析结果显示患者的累积复发率与HNRNPA1 的 高 表 达（P = 0.001，HR = 4.550，95% CI=1.932 ～10.718）、肿瘤包膜（P=0.044， HR=2.171，95%CI=1.022 ～4.610）相关。

图1 肝癌组织中HNRNPA1 的表达

3 讨 论

肝移植术后肝癌复发不仅与肿瘤本身临床特征、移植术后免疫抑制剂使用等因素相关，还涉及多个基因产物参与的复杂过程，共同决定肿瘤细胞复发转移潜能的异质性［9］。如能在早期肝癌患者中发现合适的生物学标志物，有望为肝癌肝移植患者的诊疗提供新的依据。

表1 HNRNPA1 阳性表达与临床病理学参数的相关性（例）

HNRNPA1 在消化系统肿瘤中已有不少研究报道，主要集中在分子作用机制方面［10］。既往相关研究主要以肝癌切除术患者为研究对象，较少关注早期肝癌移植患者，本研究主要结合生物信息学分析对早期小肝癌中的HNRNPA1 表达进行研究。HNRNPA1 在人体各个组织器官中均有分布［6，11］，其选择性剪接调节在整个人类转录组中普遍存在，通过与其他剪接因子协同作用［12］，并与细胞核中多种生物活动及细胞的增生转化等密切相关［13］，HNRNPA1 的表达量发生改变，并参与调控肿瘤的发生发生和转移［14］，其在各种类型肿瘤中高表达可作为早期肿瘤预后的生物标志物［15-16］。既往研究报道HNRNPA1 通过激活EGFR/MAPK/ERK 通路来调控胰岛素受体的剪接形式，或激活Ras/MAPK/ERK 通路调控功能性A-Raf 基因的剪接体来刺激肿瘤增殖［17］。同时HNRNPA1 高表达后可通过调控CD44v6 的表达来促进HCC 侵袭，可以作为肝癌切除术患者预后标志物［11，16］，最新研究发现在HBV 相关的HCC 中HNRNPA1 是miR-22 的直接靶基因，并且HNRNPA1 可能通过EGFR 信号通路起到癌基因的作用［6］，本研究首次报道小肝癌组织中HNRNPA1 高表达。HNRNPA1 高表达与患者的肿瘤包膜、血管侵犯、肿瘤复发有关，COX 回归分析结果显示HNRNPA1 高表达是小肝癌补救性肝移植预后的独立危险因素，与既往研究结果相 类似［16］。

表2 肝癌肝移植患者的1、3、5 年累积复发率及累积生存率

HNRNPA1 可能参与HCC 的发生发展过程，并与补救性肝移植患者不良预后相关。由于本研究为单中心回顾性研究，因此上述结论仍需大样本及多中心临床研究进一步证实。