8 种炮制方法对山茱萸脂溶性成分的影响

李红伟， 丁 梦， 石延榜， 郑晓珂， 冯卫生∗

（1. 河南中医药大学药学院， 河南 郑州 450046； 2. 呼吸疾病诊疗与新药研发河南省协同创新中心， 河南郑州 450046）

山茱萸始载于《神农本草经》， 云其“味酸，平。 主心下邪气， 寒热； 温中， 逐寒湿痹； 去三虫。 久服轻身”； 2015 版《中国药典》 规定， 本品为山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb. et Zucc. 的干燥成熟果肉[1］。 现代研究从山茱萸中分离并鉴定出大约300 个化合物， 以有机酸、 环烯醚萜类为主， 此外还有鞣质、 多糖、 挥发油、 脂肪油等， 其中莫诺苷和马钱子苷被广泛研究。 药理研究表明， 山茱萸及其单体具有肝脏、 肾脏、 心脏、 神经保护， 以及抗糖尿病、 抗氧化、 抗肿瘤、 抗炎、抗衰老、 抗健忘、 抗骨质疏松、 止痛、 免疫调节等作用[2］。

目前， 山茱萸临床应用以山萸肉和酒萸肉为主， 而 传统 盐炙 （ 《本草述》 ）、 清炒 （ 《局方》 ）、 麸炒（《总录》 ）、 醋蒸（《河南规范》 ）、油炙（《本草述》 ） 等炮制方法已很少应用， 但酒萸肉的炮制机理并不明确[3］。 《雷公炮炙论》 中提到“凡欲使山茱萸， 须去内核。 ……缓火熬之方用。 ……能壮元气， 秘精。 核能滑精”， 后世历代医药学家多信守之， 但也不乏有医药大家提出质疑， 如《新修本草》 指出“既干后， 皮甚薄， 当合核为用也”， 而《普济方》 出现了所载方去核、连核入药并存局面， 目前临床上仍以去核为主， 是否应该如此依然是中医药工作者争论的焦点[3-4］。山萸肉及其核中的脂溶性成分以油酸、 亚油酸为主[5-6］， 本研究以该类成分为指标， 采用GC-MS 法分析8 种炮制方法对其组成和含有量的影响， 以期为其炮制机理研究提供依据。

1 材料

Agilent 7890／7000B 三重串联四级杆气质联用仪（美国安捷伦公司）； AB204-N 型电子天平（万分之一， 杭州汇尔仪器有限公司）； Q250A3 型粉碎机（浙江松青五金厂）； N1100VWD 型旋转蒸发器（上海爱朗仪器有限公司）； JZT-2003 型天然气灶[华润燃气投资（中国） 有限公司］。

山茱萸购自亳州市中药材市场， 产地河南西峡， 经河南中医药大学董诚明教授鉴定为山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb. et Zucc. 的干燥成熟果肉及核。

正己 烷 （色 谱 纯， 批 号 20150307， 规 格500 mL， 含有量≥99.5%， 天津科密欧化学试剂有限公司）； 三氟化硼甲醇溶液（上海安谱实验科技股份有限公司， 批号20160301， 规格100 mL， 含有量≥99.5%）； 其他试剂均为分析纯。

清香米醋 （统万珍极食品有限公司， 批号20160120， 500 mL， 含有量≥3.50 g／100 mL）； 黄酒 （ 绍 兴 柯 桥 第 三 酒 厂， 批 号 20170105A，500 mL， 含有量≥14.5%）； 精制碘盐（中盐皓龙盐化有限责任公司， 批号1403240102116438，500 g， 含有量≥99.10 g／100 g）； 羊脂油来自绵羊； 麦麸（五得利面粉集团新乡面粉有限公司，批号2018032141214267404）。

2 方法

2.1 炮制品制备

2.1.1 清蒸 取净山萸肉， 照清蒸法 （通则0213） 置蒸锅内， 先用武火， 待“圆气” 后改用文火蒸至外表呈紫黑色， 熄火后焖过夜， 取出。 每100 kg 山萸肉， 加20 kg 清水。

2.1.2 盐蒸 取净山萸肉， 加盐水（0.20 g／mL）拌匀， 闷润， 置蒸锅内， 蒸至色紫黑， 取出[7］。每100 kg 山萸肉， 加2.0 kg 盐。

2.1.3 酒蒸 取净山萸肉， 照酒蒸法 （通则0213） 蒸至酒吸尽， 表面紫黑色， 取出。 每100 kg山萸肉， 加20 kg 黄酒。

2.1.4 醋蒸 取净山萸肉， 照醋蒸法 （通则0213） 蒸至醋尽并呈紫黑色。 每100 kg 山萸肉，加24 kg 醋。

2.1.5 清炒 取净山萸肉， 照单炒法 （通则0213） 置预热炒锅中， 用文火加热翻炒至表面颜色加深， 并透出固有气味。

2.1.6 麸炒 取净山萸肉， 照麸炒法 （通则0213） 炒至表面颜色加深， 筛去麦麸（即拌炒麦麸）。 每100 kg 山萸肉， 用10 kg 麸皮。

2.1.7 油炙 取净山萸肉， 照油炙法 （通则0213） 炒至油被吸尽， 表面油亮光泽， 取出。 每100 kg 山萸肉， 用20 kg 羊脂油。

2.1.8 盐炙 取净山萸肉， 加盐水（0.20 g／mL）拌匀， 照盐炙法（通则0213） 炒干。 每100 kg 山萸肉， 用2 kg 盐。

2.1.9 山萸肉及核 取新鲜成熟的山茱萸， 晒至六成干， 去核， 分别得到山萸肉及核， 两者晾晒至干。

2.1.10 清炒麦麸 按照 “2.1.6” 项下方法，取麦麸， 不加山萸肉， 炒至相同性状。 以上炮制品于烘箱中60 ℃干燥， 取出， 置干燥器中放凉备用。

2.2 脂溶性成分提取和衍生化处理 取生品和“2.1” 项下各炮制品适量， 分别加入20 倍量乙醚溶液， 索氏回流提取法（45 ℃） 提取8 h， 得到脂溶性成分， 计算得率， 公式为y=×100%， 其中y 为脂溶性成分得率； a 为山萸肉及其炮制品， 以及核和辅料分别所提取的脂溶性成分质量； b 为山萸肉及其炮制品， 以及核和辅料质量， 炮制品折合为原药材质量。

取样品0.15 g， 加入0.5 mol／L KOH 甲醇溶液4.0 mL， 65 ℃水浴皂化15 ～30 min， 冷却后加入10%三氟化硼甲醇溶液5.0 mL， 65 ℃水浴2 min，冷却后加入正己烷、 饱和NaCl 溶液各2.0 mL， 取上清液， 加入无水Na2SO4后， 过滤， 干燥。

2.3 GC-MS 分析

2.3.1 GC 条件 DB-5 型石英毛细管柱（30 m ×0.25 mm， 0.25 μm）、 DB-1701 型石英毛细管柱（60 m × 0.25 mm， 0.25 μm）； 载气为高纯氦气（含有量99.999%）； 体积流量1.0 mL／min； 进样口温度240 ℃； 不分流， 进样量0.1 μL； 升温程序为80 ℃保持1 min， 10 ℃／min 升至190 ℃，20 ℃／min 升至230 ℃， 保持5 min； 气化室温度280 ℃； 接口温度280 ℃。

2.3.2 MS 条件 碰撞气氦气； 体积流量2.0 mL／min； 氮气体积流量1.5 mL／min； 离子源为电子轰击源， 电子能量70 eV； 扫描范围m／z 45～600； 四级杆温度150 ℃； 离子源温度230 ℃；溶剂延迟4.5 min； GC-MS 接口温度240 ℃。

2.3.3 MS 检索和定量测定 应用NIST14 系统谱库自动检索组分质谱， 结合有关文献， 分别与八峰索引和EPA／NIH 对照， 匹配度均在70%以上。 化合物的定量测定采用HewlettPackard 软件， 按峰面积归一化法计算其相对含有量。 见表1。

表1 各炮制品中脂溶性成分的组成和含有量Tab.1 Compositions and contents of liposoluble constituents in various processed products

续表1

3 结果

3.1 GC-MS 分析 山萸肉生品脂溶性成分总离子流图见图1。

图1 生品脂溶性成分总离子流图Fig.1 Total ion current chromatogram of liposoluble constituents in raw product

3.2 组成和含有量分析

3.2.1 脂溶性成分 表2 显示， 山萸肉的各炮制方法均能提高脂溶性成分的提取率， 依次为油炙＞麸炒＞盐炙＞清炒＞盐蒸＞清蒸＞醋蒸＞酒蒸＞生品；与生品相比， 脂溶性成分种类以清蒸、 盐蒸、 麸炒、 盐炙、 油炙品减少， 而酒蒸、 醋蒸、 清炒品增加， 含有量均为100%； 山萸肉各炮制品中各成分含有量在99.00% 以上； 所得脂溶性成分均以饱和、 不饱和脂肪酸为主， 总含有量可达90.00%以上； 对于不饱和脂肪酸， 清蒸、 酒蒸、 盐蒸、 清炒、 油炙、 盐炙品含有量与生品相比均降低， 而醋蒸、 麸炒品均升高； 对于饱和脂肪酸， 除山萸肉醋蒸、 麸炒品含有量降低外， 其余相对于生品均升高； 核脂溶性成分提取率比山萸肉高， 不饱和脂肪酸含有量达90.20%， 主成分亚油酸、 11-油酸。 在各炮制品脂溶性成分中， 含有量大于5.00% 的有肉豆蔻酸、 软脂酸、 硬脂酸、 11-油酸、 亚油酸、木焦油酸， 见表1。

表2 不同炮制品中脂溶性成分的分析结果Tab.2 Analysis results of liposoluble constituents in various processed products

样品 提取率／% 检出成分／种（含有量／%）鉴定成分／种（含有量／%）不饱和脂肪酸／种（含有量／%）饱和脂肪酸／种（含有量／%）生品 1.40±0.20 47（100.00） 38（99.47） 7（51.77） 22（45.50）清蒸 1.63±0.40 46（100.00） 37（99.13） 6（48.94） 23（47.53）盐蒸 1.69±0.52 45（100.00） 41（99.29） 7（36.14） 24（58.94）酒蒸 1.51±0.26 52（100.00） 42（99.15） 8（29.89） 22（62.92）醋蒸 1.59±0.30 60（100.00） 44（99.09） 10（75.01） 24（22.93）清炒 2.11±0.61 54（100.00） 46（99.91） 9（43.23） 27（54.23）麸炒 2.88±0.53 44（100.00） 38（99.79） 9（77.52） 22（21.99）油炙 16.56±0.52 43（100.00） 38（99.84） 11（45.09） 24（54.65）盐炙 2.33±0.66 43（100.00） 34（98.90） 7（35.83） 20（58.70）核6.29±0.76 35（100.00） 23（99.77） 11（90.20） 10（9.53）羊脂油 - 36（100.00） 36（100.00） 13（45.53） 23（54.47）麦麸 0.85±0.13 40（100.00） 15（93.95） 5（73.53） 6（19.98）炒麦麸 0.62±0.10 41（100.00） 17（94.41） 7（75.09） 8（18.42）拌炒麦麸 0.82±0.21 29（100.00） 23（99.24） 9（77.63） 12（20.68）

相对于生品， 清炒、 拌炒麦麸中脂溶性成分提取率呈降低趋势， 所含的不饱和脂肪酸相对含有量呈升高趋势； 对于饱和脂肪酸， 清炒麦麸相对含有量呈降低趋势， 而拌炒麦麸呈升高趋势。 羊脂油生品检测结果表明， 其饱和脂肪酸含有量相对不饱和脂肪酸含有量高[8］。

3.2.2 独有成分和共有成分 独有成分和共有成分反映了山茱萸经过不同的炮制工艺后， 其所含脂溶性成分发生了化学结构改变， 产生了新成分； 共有成分反映了不同炮制品的相似程度及共同含有的脂溶性成分。 见表3。

表3 各样品脂肪酸的比较Tab.3 Comparison of fatty acids among various samples

4 讨论

山萸肉不同炮制品中用到了多种辅料， 如黄酒、 米醋等， 文献报道它们在规定用量下未检测出脂溶性成分， 故本实验排除了辅料干扰[9］。 在相同GC-MS 条件下对辅料麦麸（麦麸、 清炒麦麸、拌炒麦麸） 和羊脂油进行检测， 由表2 可以看出，麦麸清炒后脂溶性成分提取率均降低， 但拌炒麦麸升高， 表明它吸附了山萸肉受热渗出的脂溶性成分， 这与文献报道麦麸可以吸附饮片中的脂溶性成分一致[10］。 与清炒山萸肉相比， 麸炒山萸肉中脂溶性成分提取率有所升高， 同时两者在拌炒过程中渗出的脂溶性成分互相浸润[10］。 通过表3 中山萸肉生品、 清炒品、 油炙品与羊脂油炙品中的脂溶性成分比较， 可知羊脂油中部分成分可能渗入进山萸肉中， 同时也产生了（9E， 12E） -亚油酸甲酯等新成分。

2015 年版《中国药典》 收录山茱萸的炮制品有山萸肉和酒萸肉， 均具有补益肝肾、 收涩固脱的功效。 用于眩晕耳鸣、 腰膝酸痛、 阳痿遗精、 遗尿尿频、 崩漏带下、 大汗虚脱、 内热消渴等症[1］。酒蒸、 清蒸山萸肉可降低其酸性， 增强其补肝肾作用； 醋蒸山萸肉增强其收敛涩精作用； 麸炒山萸肉最早出自《总录》 荜澄茄饮方， 用于脾脏久虚、积冷不散及阴气伤寒、 喘闷坚胀、 四肢厥逆； 油炙、 盐炙山萸肉最早记载于《本草述》 中， 其中油炙山萸肉见于加减地黄丸， 用于治疗男子天元受伤、 精气耗损、 胃虚劳热、 骨体空虚、 肾脏不足、阳痿不举、 精泄不施、 或因孕而不育， 久服百病能瘥、 精神倍增、 阳生阴长， 有生生广嗣之妙而盐炙山萸肉是与补骨脂、 五味子、 人参、 盐共炒之， 用于治疗小便频数淋沥。

山萸肉8 种炮制品及其核中的脂溶性成分均以游离脂肪酸为主， 现代研究表明， 人体摄入过多饱和脂肪酸会产生脂毒性， 诱导细胞凋亡， 引发多种疾病， 如胰岛β-细胞受损， 胰岛素抵抗， 促使2型糖尿病的发生和发展， 引起肝脏疾病、 动脉粥样硬化和冠心病等。 山萸肉及其8 种炮制品中主要含有软脂酸、 硬脂酸、 肉豆蔻酸、 木焦油酸等饱和脂肪酸[11-14］， 而且所含的不饱和脂肪酸对以上成分所引发的机体损伤还具有保护作用， 这也可能是临床上山茱萸不同炮制品大多用于补肝肾方剂中的物质基础， 它们以亚油酸、 油酸为主， 不同炮制品中两者含有量之和在31% ～70%范围内， 其中亚油酸是人体无法自身合成的必须不饱和脂肪酸， 全部靠食物摄取[15-16］。 此外， 除清蒸和清炒外， 山萸肉其余6 种炮制品均产生新成分（13Z） -二十二碳烯酸， 该成分通过降低患者血浆中非分枝长链脂肪酸（VLCFA C26∶0） 的异常积累， 对X 连锁隐性遗传病—肾上腺脑白质营养不良有治疗作用， 并且可预防轻度男孩患者神经髓鞘脱失症状[17］， 这与《小儿药证直诀》 中钱乙用六味地黄丸治疗儿童“肾怯失音， 囱门不合， 神不足， 目中白睛多” 症相似， 表明在治疗X 连锁隐性遗传病—肾上腺脑白质营养不良疾病方面， 山萸肉需要炮制入药。

本实验通过对山萸肉不同炮制品中脂溶性成分的分析， 以提取率和不饱和脂肪酸含有量为指标，结果表明除醋蒸和麸炒法以外， 其他炮制方法均呈降低趋势， 包括净制去核。 通过查阅中国方剂数据库和方剂现代应用数据库， 以“山茱萸” 为主题词检索， 发现山茱萸无论是在传统应用和现代临床应用中均以山萸肉生品为主（检索得到方剂1 377个， 以生品入药1 243 个， 占90.27%）， 故不同炮制品药效学及临床功效的差异性值得深入研究， 以便于临床辨证施药。