6 种抗肿瘤中药注射液对卵巢癌细胞中ATF3 mRNA 表达的影响

张湘奇， 陈君君， 杨 姣，， 石美智， 祁美娟， 肖 霄， 韩永龙，∗

（1. 上海交通大学附属第六人民医院药剂科， 上海 200233； 2. 上海健康医学院附属第六人民医院东院药剂科， 上海 201306； 3. 上海海洋大学食品学院， 上海 201306）

卵巢癌是女性生殖系统肿瘤中发病率第二、 致死率第一的恶性肿瘤[1］， 目前临床治疗常为手术加化疗， 而国内将抗肿瘤中药注射液与化疗药物联用[2-4］以协同增强抗肿瘤效果， 提高机体免疫功能。 中药可作用于肿瘤发生发展多个环节， 具有安全性高、 价格低廉、 不良反应少等优点， 中药注射剂治疗恶性肿瘤时， 无论是在减轻临床症状、 防止复发转移、 延长生存期、 提高生存质量， 还是在与放化疗配合、 增效减毒等方面都呈现出较好的疗效[5］， 但其种类繁多， 成分复杂， 抗癌机制不明，从而限制了合理应用。

转录激活因子3 （ATF3） 是转录因子ATF／CERB 家族成员之一， 在肿瘤细胞增殖、 凋亡、 转移方面起着重要作用[6］， 近年来有研究者提出可将其作为抗肿瘤药物新靶点[7］。 本实验选取临床常用的6 种抗肿瘤中药注射液（消癌平注射液、艾迪注射液、 华蟾素注射液、 复方苦参注射液、 斑蝥酸钠维生素B6注射液、 参芪扶正注射液）， 评价其对2 种卵巢癌细胞A2780、 SK-OV-3 增殖的抑制作用及细胞中ATF3 mRNA 表达的影响， 从而筛选通过作用于ATF3 来影响肿瘤生长和转移的中药注射剂， 对相关抗癌机制研究有重要意义。

1材料

1.1 试药 消癌平注射液（南京圣和药业有限公司， 每支20 mL， 每1 mL 含1 g 通关藤， 批号201709111）； 艾迪注射液（贵州益佰制药股份有限公司， 每支10 mL， 批号20160833）； 华蟾素注射液（安徽华润金蟾药业股份有限公司， 每支5 mL， 每1 mL 含0.5 g 干蟾皮， 批号61206-1）；复方苦参注射液（山西振东制药股份有限公司，每支5 mL， 每1 mL 含2 g 苦参， 批号20170304）；斑蝥酸钠维生素B6注射液（贵州柏强制药有限公司， 每支10 mL， 每1 mL 含0.1 mg 斑蝥酸钠， 批号2016080602）； 参芪扶正注射液（丽珠集团利民制药厂， 每瓶250 mL， 批号20170511）。 胎牛血清（批 号 1932562）、 0.25% 胰 蛋 白 酶 （ 批 号1951049）、 青霉素、 链霉素溶液 （批号15140-122） （美国Gibco 公司）； DMEM 高糖培养基（批号AD17628284）、 McCOY’ 5A 培 养 基 （批 号AC13430279） （美国HyClone 公司）； 噻唑蓝MTT（批号303H0528） （北京索莱宝科技有限公司）；曲格列酮（美国Cayman 公司， CAS 号97322-87-7，货号71750）； RNA isolater Total RNA Extraction Reagent （货号R401-01， 批号7E141K7）、 HiScript ⅡQ RT SuperMix for qPCR （＋gDNA wiper） （货号R223-01， 批 号7E140L7）、 ChamQ SYBR qPCR Master Mix （High ROX Premixed） （货号Q341-02，批号7E170L7） （南京诺唯赞生物科技有限公司）。

1.2 细胞株 人卵巢癌细胞系A2780， 购自北京北纳创联生物技术研究院； 人卵巢癌细胞系SKOV-3， 购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

1.3 仪器 生物安全柜（新加坡艺思高科技有限公司， 型号Class II BSC）； 二氧化碳培养箱（日本Panasonic 公司， 型号MCO-18AIC）； 电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司， 型号ME203）； 台式低温离心机 （美国Beckman 公司， 型号Microfuge 20R）； 多功能酶标仪（奥地利Molecular Devices 公司， 型号Spectra Max i3x）； 定量PCR 仪（美国ABI 公司， 型号Pro Flex）； 实时荧光定量PCR 仪（美国Roche 公司， 型号Light Cycler 480II）。

2 方法

2.1 细胞株培养 A2780 细胞培养于含10%胎牛血清、 1%青霉素-链霉素溶液（两者终浓度分别为100 U／mL、 100 μg／mL） 的DMEM 高糖完全培养基中， 培养条件为温度37 ℃、 CO2饱和湿度5%，每2～3 d 传代1 次， 培养2 ～3 代后取对数生长期细胞进行实验。 SK-OV-3 细胞培养于含10%胎牛血清、 1%青霉素-链霉素溶液的McCOY’5A 完全培养基中， 培养条件为温度37 ℃、 CO2饱和湿度5%， 每3～5 d 传代1 次， 培养2 ～3 代后取对数生长期细胞进行实验。

2.2 中药注射液对卵巢癌细胞增殖的作用 采用MTT 法。 调整细胞悬液密度至5×104／mL， 接种于96 孔培养板中， 每孔100 μL， 即5×103细胞／孔，空白组加入相应量无细胞培养基， 细胞贴壁后根据药物浓度梯度加入含药培养基， 参考文献[8-12］和预实验， 分别确定为消癌平注射液10、 20、40 μL／mL， 艾迪注射液10、 20、 40 μL／mL， 华蟾素注射液5、 10、 20 μL／mL， 复方苦参注射液1、5、 10 μL／mL， 斑蝥酸钠维生素B6注射液50、100、 200 μL／mL， 参 芪 扶 正 注 射 液 25、 50、100 μL／mL， 而对照组、 空白组加入不含药培养基， 每组设3 个复孔， 37 ℃、 5%CO2下培养24 h。无菌PBS 缓冲液溶解MTT 粉末， 制成5 mg／mL 溶液， 每孔加入10 μL MTT 溶液继续孵育4 h， 弃去上清， 加入150 μL DMSO 振荡溶解紫色晶体10 min， 酶标仪测定490 nm 波长下吸光度（A），计算细胞增殖率， 公式为增殖率= [（实验组A-空白组A） /（对照组A-空白组A） ］ ×100%， 平行3 次， 取平均值。

2.3 中药注射液对卵巢癌细胞中ATF3 mRNA 表达的影响 采用RT-PCR 法。 细胞接种于6 孔板中， 每孔5×105个细胞， 细胞贴壁后用无血清培养基处理12 h， 用含40 μmol／L 阳性诱导剂曲格列酮[13］的完全培养基配制终浓度分别为消癌平注射液10、 20、 40 μL／mL， 艾 迪 注 射 液 10、 20、40 μL／mL， 华蟾素注射液5、 10、 20 μL／mL， 复方苦参注射液1、 5、 10 μL／mL， 斑蝥酸钠维生素B6注射液50、 100、 200 μL／mL， 参芪扶正注射液25、 50、 100 μL／mL 的药液， 而对照组只加入无药培养基， 阳性诱导组只加入含40 μmol／L 曲格列酮的完全培养基， 各浓度设置3 个复孔， 每孔完全培养基加2 mL 药物。 作用24 h 后， Trizol 法提取总RNA， 酶标仪测定RNA 纯度及浓度， 按上样1 000 ng计算各样品上样量， 根据逆转录试剂盒说明书配制20 μL 上样体系加入PCR 小管中， 置于PCR 扩增仪上， 50 ℃下运行15 min 合成cDNA，85 ℃下运行5 s 终止反应， 进行逆转录。 以逆转录得到的cDNA 为模板， 按PCR 扩增说明书加入相应量扩增溶液及引物， 20 μL 上样体系中含25 ng模板DNA、 10 μmol／L 引物、 10 μL RT-PCR Master Mix， 96 孔检测板离心后， 放入荧光定量PCR 仪上， PCR 反应条件为95 ℃下酶激活30 s， 95 ℃下变性10 s， 60 ℃下退火延伸30 s， 进行40 个循环后降温得融解曲线， 验证引物特异性。 ATF3 基因引物序列为正向TTGCCATCCAGAACAAGCACCTC（5′→3′）， 反向GCACTCCGTCTTCTCCTTCTTCTTG（5′→3′）， 平行3 次。

2.4 统计学分析 通过Graphpad prism 6.0 软件进行处理， 数据用表示， 组间比较采用单因素方差分析。 以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 中药注射液对A2780 细胞增殖的影响 图1显示， 与对照组比较， 消癌平注射液中、 高剂量组（20、 40 μL／mL）， 艾迪注射液中、 高剂量组（20、40 μL／mL）， 华蟾素注射液中、 高剂量组 （10、20 μL／mL）， 复方苦参注射液中、 高剂量组（5、10 μL／mL）， 斑蝥酸钠维生素B6注射液高剂量组（200 μL／mL）， 参芪扶正注射液中、 高剂量（50、100 μL／mL） 组对A2780 细胞增殖有显著抑制作用（P＜0.05， P＜0.01）， 并随药物浓度升高而增强。

图1 中药注射液对A2780 细胞增殖的影响Fig.1 Effects of Chinese herbal injections on A2780 cell proliferation

3.2 中药注射液对A2780 细胞中ATF3 mRNA 表达的影响 图2 显示， 40 μmol／L 曲格列酮刺激后， A2780 细胞中ATF3 mRNA 表达明显升高； 与曲格列酮组比较， 消癌平注射液低剂量组（10 μL／mL）， 华蟾素注射液中、 高剂量组（10、20 μL／mL）， 复方苦参注射液低、 中剂量组（1、5 μL／mL）， 参芪扶正注射液高剂量组（100 μL／mL）ATF3 mRNA 表达显著降低（P＜0.05， P＜0.01）， 而斑蝥酸钠维生素B6注射液高剂量组（200 μL／mL）其mRNA 表达显著增加（P＜0.01）， 约为对照组的80 倍。

3.3 中药注射液对SK-OV-3 细胞增殖的影响 图3 显示， 与对照组比较， 艾迪注射液低、 中、 高剂量组 （10、 20、 40 μL／mL）， 华蟾素注射液低、中、 高剂量组（5、 10、 20 μL／mL）， 复方苦参注射液高剂量组（10 μL／mL）， 斑蝥酸钠维生素B6注射液高剂量组（200 μL／mL） 对SK-OV-3 细胞增殖呈显著抑制作用（P＜0.05， P＜0.01）， 并随药物浓度升高而增强。

3.4 中药注射液对SK-OV-3 细胞中ATF3 mRNA表达的影响 图4 显示， 40 μmol／L 曲格列酮刺激后， A2780 细胞中ATF3 mRNA 表达明显升高； 与曲格列酮组比较， 消癌平注射液低剂量组（10 μL／mL）， 艾迪注射液中剂量组（20 μL／mL），华蟾素注射液低、 中剂量组（5、 10 μL／mL）， 复方苦参注射液低剂量组（1 μL／mL） ATF3 mRNA表达显著降低（P＜0.05， P＜0.01）； 斑蝥酸钠维生素B6注射液低、 中、 高剂量组 （50、 100、200 μL／mL） 其mRNA 表达显著增加（P＜0.01），约为对照组的100～200 倍。

4 讨论

恶性肿瘤的治疗和预后一直是临床、 基础研究的热点和难点。 以丰富的中草药宝库为基础， 近年来我国研发了数十种中药注射液来辅助临床常规的肿瘤治疗， 以期达到协同增效、 提高患者免疫力、延长生存时间、 提升生活质量的效果， 但其使用是否恰当、 是否能通过作用于有效靶点增强抗癌作用、 是否能防止肿瘤转移或免疫逃逸还需要进一步考察。

图2 中药注射液对A2780 细胞中ATF3 mRNA 表达的影响Fig.2 Effects of Chinese herbal injections on ATF3 mRNA expression in A2780 cells

图3 中药注射液对SK-OV-3 细胞增殖的影响Fig.3 Effects of Chinese herbal injections on SK-OV-3 cell proliferation

图4 中药注射液对SK-OV-3 细胞中ATF3 mRNA 表达的影响Fig.4 Effects of Chinese herbal injections on ATF3 mRNA expression in SK-OV-3 cells

本实验选择6 种临床上常用的抗肿瘤中药注射液， 其中消癌平注射液是由通关藤干燥藤茎经水提醇沉制成的中药注射剂[14］， 功效清热解毒、 化痰散结， 是肺癌、 肝癌、 消化道肿瘤的治疗药物和化疗辅助药物； 艾迪注射液由人参、 黄芪、 刺五加、斑蝥提取物制成， 临床用于治疗原发性肝癌、 肺癌、 恶性淋巴瘤、 妇科恶性肿瘤； 华蟾素注射液提取自干蟾皮， 有效成分为蟾蜍毒素类， 可抑制多种恶性肿瘤增殖、 转移， 对化疗非敏感肿瘤的疗效良好； 复方苦参注射液由苦参、 白土苓提取而成， 功效凉血解毒、 散结止痛， 临床上主要用于缓解癌肿疼痛、 减少放化疗毒副作用； 斑蝥酸钠维生素B6注射液有效成分为斑蝥酸钠， 是抗肿瘤活性成分斑蝥素的半合成衍生物， 适用于中晚期肝癌、 肺癌、宫颈癌等治疗[11］； 参芪扶正注射液提取自党参、黄芪， 功效益气扶正， 临床上用于癌症患者放化疗中增强机体免疫功能和化疗敏感性。 上述中药注射液在临床使用过程中均可与化疗药物联用以抑制肿瘤生长， 但具体机制未明。

作为一种适应性反应基因， ATF3 可参与细胞内外复杂的进程， 在静息细胞中低表达， 可被一系列应激信号（如缺氧、 DNA 损伤、 抗癌复合物等）快速诱导， 它在肿瘤形成发展过程中发挥着关键作用， 但其对肿瘤产生的效应是复杂且矛盾的， 根据诱导因素、 细胞类型、 内外环境等不同可表现为促癌或抑癌2 种截然相反的作用。 研究表明[15］，ATF3 过度表达可促进前列腺癌细胞PC-3 的能动性及侵袭性， 但也可促进其凋亡； Yin 等[7］发现， 人乳腺癌细胞中ATF3 被TGF-β 诱导而表达增加后，可通过上调Slug、 Snail 等侵袭促进因子的转录来抑制细胞凋亡， 并促进癌细胞转移； Chang 等[16］报道， ATF3 高表达可能与使用紫杉醇引起的乳腺癌肺转移有关， 沉默该因子后可显著减少乳腺癌转移和复发； ATF3 在卵巢癌中作用的研究报道较少，目前已有报道该因子在晚期卵巢乳头状浆液性癌老年患者中表达升高， 并与复发转移率直接相关[17］，有研究已将抑制其作为评价卵巢癌有效治疗和是否有转移可能的重要指标[18-19］。

本实验检测6 种中药注射剂对2 种卵巢癌细胞A2780、 SK-OV-3 增殖的抑制率及ATF3 mRNA 表达。 前期报道， 曲格列酮可作为ATF3 阳性诱导剂， 刺 激 其 mRNA 表 达 升 高[13］， 本 实 验 选 择40 μmol／L作为诱导剂量。 结果表明， 各中药注射液在一定浓度内均可抑制A2780、 SK-OV-3 细胞增殖， 并呈浓度依赖性， 其中消癌平注射液在不影响肿瘤细胞增殖的低浓度下可抑制ATF3 mRNA 表达； 艾迪注射液对A2780 细胞中ATF3 mRNA 表达的作用不明显， 但20 μL／mL 下可抑制SK-OV-3 细胞增殖， 并对其mRNA 表达有抑制作用； 较低浓度华蟾素注射液对2 种细胞增殖率及ATF3 mRNA表达均有抑制作用； 高浓度（100 μL／mL） 参芪扶正注射液可抑制A2780 增殖， 并下调ATF3 mRNA表达； 消癌平注射液、 艾迪注射液、 华蟾素注射液、 复方苦参注射液在较高浓度时有诱导ATF3 mRNA 高表达的趋势， 虽然不明显， 但仍应引起研究者重视； 斑蝥酸钠维生素B6注射液对卵巢癌细胞中ATF3 的诱导能力非常强， 可将其mRNA 表达增加至约 100 倍以上， 可能与其浓度太高（200 μL／mL） 引起细胞应激有关， 也有可能是斑蝥酸钠可直接诱导其mRNA 表达， 该中药注射液作为抗肿瘤药物或放化疗辅助药物使用时， 是否可能通过诱导ATF3 来引起肿瘤复发和转移仍需进一步基础研究及临床实验。

综上所述， 华蟾素注射液可抑制卵巢癌细胞A2780、 SK-OV-3 的增殖， 并下调ATF3 mRNA 表达， 而斑蝥酸钠维生素B6注射液可大幅上调卵巢癌细胞中其mRNA 表达。 中药注射剂要求大量基础研究去阐明其作用机制， 而ATF3 作为与肿瘤凋亡、 转移相关的重要作用靶点， 有望作为评价药物抗癌及预后的指标之一。