利用高通量测序法对模拟增温条件下藏北高寒草甸土壤线虫群落的研究

侯 磊，薛 蓓，薛会英

(西藏农牧学院，西藏 林芝 860000)

土壤线虫作为土壤动物中的优势类群，是草地生态系统中的消费者，关系到草地生产力的增减[1]。藏北草地位于青藏高原腹地，是该区域最为主要的生态系统类型。该生态系统极为脆弱，对人为干扰和气候变化的响应十分敏感，遭破坏后很难短期内恢复，故而可能影响草场质量和牧民生产生活[2]。目前，气候变暖已成既定事实[3]，并且持续升温，据预测本世纪末全球平均气温将升高1.8～4.0℃[4]，而高海拔地区温度的增幅和响应将更为显著和迅速[5-6]。随着青藏高原暖化，藏北草地的生态系统特征也将随之改变，目前这方面研究集中在藏北草地植物生物量、多样性和物候等方面[7-10]。作为该生态系统的一部分，藏北草地土壤线虫的研究也局限于草地植物群落对其的影响[11-13]，其对增温有何响应，目前了解甚少。

王学霞等[14]通过在藏北高寒草甸的OTC(open top chamber，OTC)增温试验，研究了长期增温和短期增温对土壤线虫群落的影响，认为增温降低了土壤线虫数量。该研究采用传统的土壤线虫形态学分离鉴定法，虽然能比较准确的反映线虫群落状况，但费时费力[15]。随着分子生物学和生物信息学的高速发展，高通量测序技术广泛应用于微生物的研究[16-18]，在线虫方面也得到一些应用，用以分析线虫群落特征及其对植物群落的响应[19-20]，但在青藏高原土壤线虫及其增温响应方面还未见该技术的应用。

本研究采用OTC模拟增温方法，利用高通量测序技术对藏北高寒草甸土壤线虫的群落组成进行分析，讨论增温对土壤线虫群落的影响，有助于理解线虫群落对增温的适应过程，增强对气候变暖影响的认识，为藏北高寒草甸的管理维护提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 样地概况

藏北高寒草原呈高原水平地带性分布(海拔4 300～5 200 m)，高原大陆性气候特征极为明显，暖季短且温凉，冷季长且寒冷，年平均气温-2.8～1.6℃，全年无绝对无霜期，最冷月(1月)、最热月(7月)平均气温分别为-10～-12℃和7～12℃，≥0℃年积温800～1 100℃，年降水量100～300 mm，年蒸发量1 500～2 300 m，干燥度6.7～20[21]。

试验样地设置在西藏自治区那曲市色尼区克玛村中国科学院青藏高原研究所那曲生态环境综合观测研究站内(31°31'38″～31°32'02″N，92°04'03″～92°04'16″E)，土壤为高山草甸土，植物主要优势种及亚优势种有高山嵩草(Kobresiapygmaea)、矮火绒草(Leontopodiumnanum)、矮生嵩草(K.humilis)、二裂委陵菜(Potentillabifurca)、钉柱委陵菜(P.saundersiana)、乳白香青(Anaphallislactea)等[22]。

2017年5月，在研究站固有围栏样地内设置3个OTC装置作模拟增温处理，面积均为2.5 m×2.5 m，每个OTC间距均大于100 m，整体呈等边三角形设置。在等边三角形中心位置设置1个空白对照试验样地。围栏样地内地势平坦，落差不足5 m。

1.2 土样采集及土壤理化指标测定

2017年8月，在OTC装置内及其形成的等边三角形几何中心位置采样，分别采集0～5，5～10，10～15，15～20，20～25 cm共5个深度的土层原状土样，装入无菌采样袋中，放入冰盒内，于12 h内带回实验室置于-80℃冰箱内保藏备用。将土壤样品按照不同深度及OTC内外进行样品编号，将OTC内0～5，5～10，10～15，15～20，20～25 cm的土壤样品分别编号为OTC1，OTC2，OTC3，OTC4和OTC5，将OTC外0～5，5～10，10～15，15～20，20～25 cm的土壤样品分别编号为OTCW1，OTCW2，OTCW3，OTCW4和OTCW5。0～5 cm处OTC内土温比OTC外土温平均高出2.4℃，5～10 cm处平均高出1.9℃，10～15 cm处平均高出1.0℃，15～20 cm处平均高出0.8℃，20～25 cm处平均高出0.8℃。

土壤pH值采用酸度计法，含水率采用烘干法，有机质采用重铬酸钾容量法，铜、锌采用原子吸收法，氮采用半微量开氏法，磷采用氢氧化钠熔融-钼锑抗比色法，钾采用氢氧化钠熔融法[23]。

1.3 DNA抽提和PCR扩增

根据E.Z.N.A.®soil试剂盒(Omega Bio-tek，Norcross，GA，US)说明书进行总DNA抽提，DNA浓度和纯度利用NanoDrop2000进行检测，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量；引物采用NF1F-18Sr2bR，即NF1F 5’-GGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTT-3’和18Sr2bR 5’-TACAAA GGGCAGGGACGTAAT-3’引物[24]，进行PCR扩增[25]。PCR扩增正式试验采用TransGen AP221-02：TransStartFastpfu DNA Polymerase，20μL反应体系如下：5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mM dNTPs 2 μL，Forward Primer(5uM)0.8 μL，Reverse Primer(5uM)0.8 μL，FastPlu Polymerase 0.4 μL，BSA 0.2 μL，Template DNA 10ng，补ddH2O至20 μL。PCR仪：ABI GeneAmp® 9700型。PCR反应参数：

1.4 Illumina Miseq测序

委托上海美吉生物医药科技有限公司利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序。

1.5 数据处理及分析

在上海美吉生物医药科技有限公司云平台上进行在线分析(www.i-sanger.com)。其他数据处理采用SPSS20.0软件。

原始测序序列使用Trimmomatic质控软件，使用FLASH软件进行拼接：设置50 bp的窗口，若窗口内平均质量值低于20，则从窗口开始截去后端碱基，去除质控后长度低于50 bp的序列。barcode需精确匹配，引物允许2个碱基的错配，去除模糊碱基。根据重叠碱基overlap将两端序列进行拼接，overlap需大于10bp。去除无法拼接的序列。使用UPARSE软件(version 7.1)，根据97%的相似度对序列进行OTU聚类。使用UCHIME软件剔除嵌合体。利用RDP classifier对每条序列进行物种分类注释，比对NCBI(NT)，设置比对阈值为70%[26]。

利用冗余分析反映土壤线虫与土壤环境因子的关系。

2 结果与分析

2.1 OTU组成分析

在97%相似度下用QIIME软件将有效序列聚类为用于物种分类的OTU (Operational taxonomic unit)，根据多样性指数为sobs(表征实际观测到的物种数目)做稀释曲线。10个样品的稀释曲线如图1所示，曲线均趋于平坦，增加数据总量对OTU没有影响，样本OTU覆盖度基本饱和，说明所得序列能基本反映土壤生物群落结构。

图1 OTC内外土壤生物测序的稀释曲线Fig.1 Rarefaction curves of each sample

2.2 OTC内外土壤生物组成分析

2.2.1纲分类水平上OTC内的土壤生物分布 纲水平各样本土壤线虫群落分布图如图2，在OTC1，OTCW1，OTC2，OTCW2，OTC3，OTCW3，OTC4，OTCW4，OTC5和OTCW5中刺嘴纲(Enoplea)是优势土壤线虫群落，分别占到各样本线虫群落的72.13%，61.42%，80.51%，70.05%，76.79%，50.21%，54.72%，31.43%，77.90%和55.42%；其次为色矛纲(Chromadorea)，在OTC1，OTCW1，OTC2，OTCW2，OTC3，OTCW3，OTC4，OTCW4，OTC5和OTCW5相对丰度为17.54%，29.46%，12.04%，23.65%，12.62%，46.91%，28.13%，51.47%，16.92%和35.26%。从图2可知，在0～5，5～10，10～15，15～20，20～25 cm土壤样品中，土壤线虫群落构成分布都呈现明显的规律：即OTC外的色矛纲(Chromadorea)的相对丰度都较OTC内的大，OTC外的刺嘴纲(Enoplea)的相对丰度都较OTC内的小。

图2 纲水平各样品生物比例分布图Fig.2 Species proportion distribution of each sample at the Class level

2.2.2目分类水平上OTC内外的土壤生物分布 目水平各样本土壤线虫群落分布图如图3，在10个样本中属于土壤线虫的群落目分别是矛线目(Dorylaimida)、垫刃目(Tylenchida)、未分类的线虫目(unclassified_p_Nematoda)、三矛目(Triplonchida)、小杆目(Rhabdtida)、刺嘴目(Enoplida)和疏毛目(Araeolaimida)这7个目。其中矛线目(Dorylaimida)在10个样本中含量均较高，在OTC1，OTCW1，OTC2，OTCW2，OTC3，OTCW3，OTC4，OTCW4，OTC5和OTCW5相对丰度分别为70.85%，61.25%，79.49%，66.70%，75.99%，47.35%，48.13%，30.73%，62.57%和15.02%；其次为垫刃目(Tylenchida)，在OTC1，OTCW1，OTC2，OTCW2，OTC3，OTCW3，OTC4，OTCW4，OTC5和OTCW5相对丰度分别为：11.71%，13.28%，10.31%，21.66%，11.35%，46.69%，22.72%，49.90%，15.37%和34.07%；刺嘴目(Enoplida)在OTC5中的相对丰度较高，含量分别7.49%；三矛目(Triplonchida)在OTCW5中相对丰度较高，含量为37.91%。从图3可知，在0～5，5～10，10～15，15～20，20～25 cm土壤样品中，土壤线虫群落构成分布都呈现明显的规律：即OTC内的矛线目(Dorylaimida)的相对丰度都较OTC外的大，OTC内的垫刃目(Tylenchida)的相对丰度都较OTC外的小。

图3 目水平OTC内外土壤生物差异检验柱形图Fig.3 Species proportion distribution of each sample at the Order level

2.2.3OTC内外土壤线虫群落结构的差异 为进一步分析土壤线虫群落与不同样品间的关系，在属分类水平上对各样品所含土壤生物进行聚类，构建含有样本聚类关系树、系统发育树的热图(heatmap)，该图能够反映在属分类水平各生物群落结构的差异(图4)。由图4可知，OTC2和OTCW2群落组成是最相似的，从OTCW5、OTCW3、OTCW4、OTC5、OTC4、OTC1、OTC3、OTCW1、OTC2到OTCW2群落的组成相似性有一个递增的趋势。热图中共显示30 个土壤线虫属，分别为Sakia、Lelenchus、Prismatolaimus、Tylenchus、Meloidoderita、Ecphyadophora、Tylencholaimus、Paratrichodorus、Clavicaudoides、Acrobeloides、Aphelenchoides、Filenchus、Boleodorus、Alaimus、Dorylaimellus、unclassified_p_Nematoda、Pratylenchus、Merlinius、Meloidogyna、Aphelenchus、Paravulvus、Odontolaimus、Hoplolaimus、Trichodorus、Longidorus、Cylindrolaimus、Acrobeles、Ecumenicus、Rhabdolaimus、Belonolaimus、Proleptonchus、Ditylenchus、Malenchus、Aglenchus、Mononchoides、Eucephalobus、Basiria。热图中的OTCW5、OTCW4、OTC3检测到15个生物属，OTC1、OTCW2检测到17个生物属，OTCW3、OTCW1检测到14个生物属，OTC2、OTC4、OTC5分别检测到18个、16个和13个生物属，OTC1、OTCW2检测到17个生物属。在属分类水平上，土壤生物根据进化关系聚类为6大分支，其中样本OTC1、OTC3、OTCW1、OTC2和OTCW2构成一支，样本OTCW5、OTCW3、OTCW4、OTC5、OTC4独自构成一支，这说明样本OTCW5、OTCW3、OTCW4、OTC5、OTC4与其他5个样本有明显的不同。此外，OTC2和OTCW2土壤生物进化关系较近，OTC1和OTC3土壤生物进化关系较近、OTCW1居于OTC3和OTC2之间且趋近于OTC2。

图4 OTC内外的土壤生物heatmap图Fig.4 Heatmap of different sample

2.3 线虫群落与土壤理化指标的关系

OTC内外土壤理化指标见表1。

第一主轴和第二主轴对土壤线虫群落相对丰度方差的解释比例分别为14.92%和9.04%，两者共解释23.96%的方差变化(图5)。第一主轴上，Cu(Cu2+)和Zn(Zn2+)是主要的影响因子，相关系数分别为0.9812和-0.9985。第二主轴上，YJZ(有机质)和pH是主要的影响因子，相关系数分别为-0.9881和0.9996。综上，与土壤纲水平线虫群落相关性较大的土壤理化指标是Cu2+、Zn2+、有机质和pH、K+、Cu2+、含水率、有机质与刺嘴纲(Enoplea)有较强正相关性，pH、Zn2+、N与刺嘴纲(Enoplea)呈负相关。K+、Cu2+、含水率、pH与色矛纲(Chromadorea)有较强正相关性，有机质、Zn2+、N与色矛纲(Chromadorea)呈负相关。

表1 试验地土壤基本理化性质Table 1 The basic physical and chemical properties of experimental soil

注：同列字母不同表示差异显著(P<0.05)

Note：Different letters in the same column indicate significant differences at the 0.05 level

图5 纲分类水平土壤线虫群落与土壤理化指标的冗余分析Fig.5 Redundancy analysis of nematode and soil physical and chemical parameters

3 讨论与结论

土壤线虫对气候变暖有响应。青藏高原土壤线虫对增温的响应研究少见报道，虽有学者研究，但仍采取传统的线虫形态学鉴定方法，讨论的是短期增温和长期增温条件下土壤线虫的多样性及不同营养类群线虫的变化对比[14]。就目前的研究而言，增温对土壤线虫的影响是确定的，但不同学者的看法不同。一种观点认为土壤线虫畏热，增温使其多样性减少[27]；另一种观点则认为土壤线虫多样性与温度正相关[28-29]。土壤线虫的不同营养类群和种属对增温的响应也不相同[30-32]。本研究未从土壤线虫多样性和种属、营养类群角度探究其对增温的响应，而是从纲、目分类学水平上探讨了土壤线虫相对丰度的变化，得出一个较为宏观的结果。此外，研究表明土壤线虫对增温的响应也与不同地区的具体气候密切相关。例如，Ruess等[30]在极地和Simmons等[33]在南极洲干谷所做的土壤增温试验，所得结论完全相反，前者认为土壤线虫与温度显著正相关，后者认为是负相关。更有在其他地区的研究结果表明增温对土壤线虫群落无显著影响[34-35]。这种矛盾结果证明土壤线虫对增温的响应与地区气候及生态类型有关。土壤条件也会影响到土壤线虫群落的状况，比如N和pH就会影响土壤线虫的群落变化[36-37]。藏北草地本身就是一个独特的生态系统类型，又具有独特的气候条件，该地区土壤线虫对增温的响应，与其他地区相比必然有不同之处。这种不同还需系统深入的研究和讨论。

通过高通量测序方法的分析，藏北高寒草甸土壤线虫群落对增温有一定的响应。在土壤各层次中，OTC内色矛纲线虫的相对丰度都较OTC外小，OTC内刺嘴纲线虫都较OTC外大；OTC内矛线目线虫的相对丰度都较OTC外大，OTC内垫刃目线虫都较OTC外小。土壤理化指标Cu2+、Zn2+、有机质和pH与藏北草甸土壤纲水平线虫群落相关性较大。其中，K+、Cu2+、含水率、有机质与刺嘴纲有较强正相关性，pH、Zn2+、N与刺嘴纲呈负相关。K+、Cu2+、含水率、pH与色矛纲有较强正相关性，有机质、Zn2+、N与色矛纲呈负相关。今后应当持续观测藏北高寒草甸长期增温和不同增温幅度下的土壤线虫群落变化，增强高通量测序在藏北草地土壤环境研究中的应用，以探究土壤环境的气候变化适应过程，为进一步完善藏北草地生态系统研究及可持续管理提供理论支持。