肺癌组织中FOXK1、SPON2蛋白表达变化及意义

曹莉旻，李艳，赵秋菊，田玲艳

(连云港市第二人民医院，江苏连云港222000)

肺癌是严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤之一，其发病率高居全球恶性肿瘤之首[1]。肺癌病死率高，据统计，每年因肺癌死亡的病例约占所有肿瘤死亡人数的1/5[2]。尽管近年来随着基础医学及相关学科的发展，临床诊治手段不断进步，肺癌患者的预后仍不尽如人意。肺癌的高转移、高复发是影响患者术后生存时间与生存质量的重要原因[3]。影响肿瘤转移、复发的因素很多，其中上皮-间质转化(EMT)被认为是肿瘤细胞获得浸润、转移能力的重要影响因素[4]。叉头框(FOX)家族是与机体器官发育、免疫代谢调节相关的蛋白转录因子[5]，多种FOX基因能够通过EMT干预肿瘤的形成与转移[6]。脊椎蛋白2(SPON2)属于mindin-F-spondin家族，是一种细胞外基质分泌蛋白[7]，参与构成并影响肿瘤及相关的微环境。目前关于SPON2在肺癌组织中表达的研究少见报道。本研究观察肺癌组织中FOXK1、SPON2蛋白表达变化，并探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取本院2013年1月～2017年7月收治的肺癌患者81例，男58例，女23例；年龄<60岁39例，≥60岁42例；鳞状细胞癌(鳞癌)54例，腺癌27例；肿瘤分化程度:高分化7例，中分化45例，低分化29例；TNM分期:Ⅰ期11例，Ⅱ期40例，Ⅲ期27例，Ⅳ期3例；淋巴结转移34例，无转移47例。患者纳入标准：经病理检查确诊为肺癌；临床资料完整，组织标本完好；未合并其他恶性肿瘤及其他影响免疫组化结果的严重疾病。排除标准：术前接受其他抗肿瘤手段治疗；失访；有不明原因明显异常的生化指标。于肺叶切除术、局部肺切除、全肺切除及支气管袖状切除术中切取组织标本，肺癌组织标本取自癌组织中心非坏死部位，癌旁组织标本取自距离癌组织边缘5 cm以上的无癌肺组织。标本均于术后经病理检查确诊，并制成蜡块标本保存。本研究经医学伦理委员会批准，患者及家属知情同意。

1.2 肺癌及癌旁组织中FOXK1与SPON2蛋白表达检测 采用免疫组化法。将蜡块组织标本以4 μm为间隔连续切片，脱蜡、水化。加入3% H2O2溶液浸泡10 min去除内源性过氧化物酶。加入枸橼酸钠缓冲溶液，高温高压修复抗原。加入5% BSA室温封闭1 h。滴加一抗(FOXK1兔抗多克隆抗体、SPON2兔抗多克隆抗体，购自美国ProteintechGrou公司)，4 ℃孵育过夜。待切片恢复至室温，滴加二抗(即用型辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG，购自上海宝曼生物科技有限公司)，室温孵育2 h。DAB显色，光学镜下控制显色程度，苏木素复染。梯度乙醇脱水，二甲苯透明。中性树胶封片。阴性对照组以PBS为一抗。染色结果由两位病理科医师独立判断，FOXK1主要定位于细胞核，SPON2主要定位于细胞质。于光学显微镜下(×400)取5个不同视野，每个视野至少含100个细胞。根据阳性细胞百分比计分，阳性细胞百分比<5%计0分，阳性细胞百分比5%～25%计1分，阳性细胞百分比26%～75%计2分，阳性细胞百分比>75%计3分；根据染色程度计分，无染色计0分，淡黄色计1分，黄色至棕黄色计2分，棕褐色至褐色计3分。以上两项计分乘积>1为目标蛋白表达阳性。

1.3 随访 以患者术后出院为观察起点，用电话等电子通讯手段，结合患者复诊病历，对患者及家属进行随访。对患者的恢复、复发、生存进行登记，以比较不同组患者的无进展生存期(PFS)。随访截止至2018年7月，随访时长6～48(18.20±8.21)个月，中位随访时长16个月。

1.4 统计学方法 采用SPSS22.0统计软件。计数资料组间比较采用χ2检验，两组变量的相关性检验采用Spearman等级相关。绘制Kaplan-Meier生存曲线，用Log-Rank检验分析患者预后。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺癌及癌旁组织中FOXK1、SPON2蛋白表达比较 肺癌及癌旁组织中FOXK1蛋白阳性表达率分别为64.20%(52/81)、1.23%(1/81)，比较差异有统计学意义(P<0.05)；SPON2蛋白阳性表达率分别为75.31%(61/81)、23.46%(19/81)，比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 肺癌组织中FOXK1、SPON2蛋白阳性表达与患者临床病理参数的关系 肺癌组织中FOXK1蛋白阳性表达与肿瘤TNM分期高、淋巴结转移有关(P均<0.05)，而与患者性别、年龄及肿瘤病理类型、分化程度、大小无关(P均>0.05)；SPON2蛋白阳性表达与肿瘤病理类型、分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关(P均<0.05)，而与患者性别、年龄、肿瘤大小无关(P均>0.05)。见表1。

2.3 肺癌组织中FOXK1、SPON2蛋白表达的相关性 Spearman等级相关分析结果显示，肺癌组织中FOXK1与SPON2蛋白表达呈正相关(r=0.588，P=0.000)。

2.4 肺癌组织中FOXK1、SPON2蛋白表达与患者预后的关系 肺癌组织中FOXK1蛋白阳性表达患者无进展生存率为11.54%(6/52)、PFS为(15.30±3.62)个月，阴性表达患者的无进展生存率为31.03%(9/29)、PFS为(23.92±3.19)个月，二者无进展生存率、PFS比较差异有统计学意义(P均<0.05)。见图1。肺癌组织中SPON2蛋白阳性表达患者的无进展生存率为13.11%(8/61)、PFS为(16.71±4.02)个月，阴性表达患者的无进展生存率为35.00%(7/20)，PFS为(23.50±2.88)个月，二者无进展生存率、PFS比较差异有统计学意义。见图2。

表1 肺癌组织中FOXK1、SPON2蛋白阳性表达与患者

图1 肺癌组织中FOXK1蛋白阴性表达与阳性表达患者的Kaplan-Meier生存曲线

3 讨论

肺癌按病理类型可分为鳞癌、腺癌、小细胞癌及大细胞癌，临床以鳞癌与腺癌多见，后两种较为罕见。绝大部分肺癌起源于支气管黏膜上皮[8]。生理状态下，典型的肺组织上皮细胞之间排列规则，连接紧密，而间叶细胞则相反。因此当肺癌细胞发生EMT即癌细胞失去上皮表型获得间质表型时，癌细胞出现细胞极性丢失、胞间连接松散、黏附能力下降等，使肺癌细胞获得迁移和侵袭能力[9]。因此EMT与肺癌的发生发展与转移密切相关。

图2 肺癌组织中SPON2蛋白阴性表达与阳性表达患者的Kaplan-Meier生存曲线

FOX转录因子家族所编码的一系列蛋白质，参与调控机体细胞生长、分化，胚胎发育及多种病理过程[10]。FOXK1定位于人染色体7p22，有FOXK1a、FOXK1b两个亚型，目前未见两个亚型功能不一致的报道。Li等[11]结合体外细胞试验与临床数据发现，在卵巢癌组织中FOXK1能够通过调控p21蛋白的表达，促进卵巢癌细胞的增殖与侵袭；Xu等[12]则发现FOXK1能够激活Snail蛋白的转录，从而促进神经胶质瘤细胞的增殖与迁移，敲除了FOXK1基因的神经胶质瘤细胞的侵袭力与EMT作用受到显著抑制；同样关于神经胶质瘤的研究发现，FOXK1能够激活Wnt/β-catenin信号通路，调控β-连环蛋白(β-catenin)、c-myc基因和细胞周期蛋白等多种肿瘤相关因子的表达，从而促进癌细胞增殖、浸润、转移[13]。而p21、Snail、Wnt/β-catenin等已被证实通过促进癌细胞的EMT参与肺癌的发生与侵袭[14～16]，由此可以推断FOXK1可能参与促进肺癌的形成。本研究结果显示，FOXK1蛋白在肺癌组织中的表达高于癌旁组织，且与肺癌的TNM分期、淋巴结转移等临床病理参数相关，进一步支持以上研究结论。

SPON2编码的蛋白质Spondin-2是一种细胞外基质分泌蛋白。1999年，Manda等[17]即通过mRNA差异显示技术发现，SPON2在肺癌组织与无癌肺组织中的表达存在差异，但未见关于其机制的进一步研究。而关于SPON2在其他肿瘤中的研究结果显示，SPON2的作用十分复杂。Qian等[18]发现，SPON2与雄激素受体存在相互作用，能够促进前列腺癌的增殖与转移；Schmid等[19]则发现，SPON2是结肠癌转移相关基因1的作用靶点之一，在结直肠癌组织中呈过表达，且促进结直肠癌细胞的转移，高表达的SPON2提示患者预后较差。SPON2可增强胃癌细胞侵袭力[20]。Zhu等[21]关于肝细胞癌的研究却表明，SPON2通过与过氧化物酶体增殖剂激活受体α(PPARα)的作用，抑制肝癌细胞的转移。这可能由于肝脏、心血管组织中PPARα高表达，但罕见于其他组织。本研究结果显示，SPON2蛋白在肺癌组织中的表达高于癌旁组织，且与肺癌的分化程度、TNM分期、淋巴结转移等临床病理参数相关。值得一提的是，本研究中SPON2蛋白表达与肺癌组织的病理类型相关，可能是由于不同病理类型肺癌组织受体的分布不同，关于SPON2具体作用机制的研究可从此处着手。 本研究结果显示，肺癌组织中FOXK1与SPON2蛋白表达呈正相关，因此FOXK1与SPON2可能存在协同作用，这对进一步深入研究肺癌的发展机制提供了方向，有待后续进一步研究。本研究随访结果显示，与FOXK1与SPON2蛋白阴性表达患者比较，FOXK1与SPON2蛋白阳性表达的肺癌患者无进展生存率低、PFS短，即FOXK1与SPON2蛋白阳性表达的肺癌患者预后差。因此提示临床对此类患者应加强其他抗肿瘤治疗。

综上所述，肺癌组织中FOXK1与SPON2蛋白呈高表达，二者可能协同作用参与肺癌的发生发展，影响患者预后。因此检测FOXK1与SPON2的表达对判断肺癌患者的临床特征及预后有一定价值。但本研究仅纳入81例样本，代表性不足；且由于FOXK1与SPON2基因的特性，在各组织中表达的定量检测较为困难，本研究采用免疫组化法对二者的蛋白表达进行定性检测，可能造成结果不够精确。因此关于本研究的结论尚需其他研究来佐证。