基于液相色谱-高分辨质谱的代谢组学技术用于麦卢卡蜂蜜的甄别

严丽娟, 徐敦明*, 薛晓锋, 林立毅, 赖 康, 王建文, 张志刚

(1. 厦门海关检验检疫技术中心, 福建 厦门 361026; 2. 中国农业科学院蜜蜂研究所, 北京 100093; 3. 四川省蜂业管理站, 四川 成都 610042)

麦卢卡蜂蜜采自名为麦卢卡(manuka)的天然红茶树,被誉为“新西兰国宝”。麦卢卡蜂蜜具有上佳的抗菌活性,是世界上已经批准的医用级蜂蜜,主要用于促进伤口愈合、改善口腔及胃肠道健康等[1]。虽然麦卢卡蜂蜜价格昂贵,但因其神奇的功效,在市场上一直供不应求。早在2013年,麦卢卡蜂蜜的质量问题就引起了广泛关注。据统计,麦卢卡蜂蜜的年产量只有1 700吨,但全球市场上以“麦卢卡”名义售出的新西兰蜂蜜却高达1万吨。

麦卢卡蜂蜜的鉴定通常采用蜂蜜孢粉学分析法,辅以感官和理化分析,但是这种方法比较主观,而且对技术水平的要求很高,有时会给出错误结果。蜂蜜的营养特性依赖于特定的化学成分,而这些成分随蜜源的不同而不同。因此,基于蜂蜜物质组成的鉴别方法具有很好的应用前景。

目前鉴别蜂蜜是否掺假的方法包括稳定碳同位素比值分析法、薄层色谱法、高效阴离子交换色谱法、高效液相色谱法等[2,3]。食品的基质非常复杂,传统方法大多只检测蜂蜜中数目有限的指标,无法对其真实属性进行全面分析,因此亟须具有可预测性和非目标性的检测技术对物质组成、产地等真实属性进行有效鉴定[4]。代谢组学基于全面分析小分子代谢物,结合多变量统计方法[5],可以对蜂蜜的代谢指纹谱进行综合分析。核磁共振技术(NMR)在蜂蜜代谢组学中得到了较为广泛的应用,例如NMR与模式识别方法联用实现了阿根廷、匈牙利、意大利等国家13种蜂蜜的产地鉴别,并且成功区分了6种意大利单花蜜和杂花蜜[6-9]。

在代谢组学研究领域,液相色谱-质谱法具有更高的灵敏度和分辨率,同时兼顾无偏向性,已经逐渐成为代谢组学研究的主流技术[10]。国内外研究者已经将液相色谱-质谱技术用于单花蜂蜜和杂花蜂蜜,以及不同产地蜂蜜的鉴别[11-17],针对麦卢卡蜂蜜也发展了相应的靶向分析方法[14,15]。本研究采用基于液相色谱-高分辨质谱的非靶向代谢组学技术对麦卢卡蜂蜜以及国内主要蜂蜜品种(包括油菜蜜、槐花蜜、枣花蜜等)的代谢物进行全面分析,建立了模式识别模型,并筛选标志性代谢物,实现了对麦卢卡蜂蜜的真伪鉴别。该法对蜂蜜的质量控制具有重大意义。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

UltiMate 3000 UHPLC液相色谱仪、Q-Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪(美国Thermo公司); Allegra 64R型高速冷冻离心机(美国Beckman公司); 12通道半自动固相萃取装置(美国Supelco公司);旋涡混合器(德国IKA公司);全自动氮吹浓缩仪(美国Capiler Life Sciences公司); Prime HLB固相萃取柱(60 mg/3 mL,美国Waters公司)。

甲醇和乙腈(色谱纯)购自德国Merck公司;甲酸(色谱纯)购自美国Fluka公司;盐酸(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司。实验用水由Milli-Q系统(美国Millipore公司)制得。

本研究联合中国农业科学院蜜蜂研究所,共收集到来源可靠的212例样本,包括20例麦卢卡蜂蜜、66例油菜蜜、51例槐花蜜、31例百花蜜、15例枣花蜜、11例柑橘蜜、9例荆条蜜和9例椴树蜜。样品均由专人采集,并由专业人士进行严格的品种鉴别。

1.2 蜂蜜样品前处理

准确称取2.0 g蜂蜜样品,置于10 mL离心管中,加入0.01 mol/L HCl (pH=2),定容至10 mL,涡旋混合至完全溶解,以10 000 r/min高速离心10 min,吸取5 mL上清液转移至Prime HLB固相萃取柱,用3 mL水淋洗,再用3 mL甲醇洗脱,于40 ℃氮气吹干,加入0.6 mL 0.1%(v/v)甲酸水-乙腈(7∶3, v/v)溶解后,过0.22 μm尼龙滤膜。

从每个样品中取出等量部分进行混合,制备成质控样品(QC),用于监控仪器的灵敏度和稳定性,并用于后续的代谢组数据矫正。

1.3 代谢组学分析

对于提取得到的代谢物,采用Q-Exactive高分辨质谱仪,在正离子和负离子两种扫描模式下,获得完整的代谢指纹图谱。

1.3.1色谱条件

色谱柱:Waters HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm);柱温:50 ℃;流动相:(A)0.1%(v/v)甲酸水溶液和(B)0.1%(v/v)甲酸甲醇溶液;流速:0.4 mL/min。梯度洗脱程序:0～2.0 min, 0%B～35%B; 2.0～18.0 min, 35%B～100%B; 18.0～21.0 min, 100%B; 21.0～21.2 min, 100%B～0%B; 21.2～24.0 min, 0%B。进样体积:10 μL。

1.3.2质谱条件

离子源为电喷雾电离(ESI)源;电压为3.5 kV;质谱扫描范围为m/z100～1 000; 全谱扫描分辨率为17 500;数据采集模式为棒状质谱图模式(centroid mode)。采用数据依赖采集方法(DDA)获得代谢物的MS/MS信息,扫描范围为m/z100～1 500;碰撞能量(CE)为25、35和45 eV。

序列分析采用样品随机进样方式。实际样品分析前连续5次进样QC样品,用于仪器平衡；每20个样本插入1个QC样品和溶剂空白样品；测定队列的最后再次重复测定3次QC样品。

1.3.3数据处理

原始数据采集后,利用Compounds Discoverer(CD)软件进行处理:数据导入、峰提取、峰对齐、代谢物信息提取、代谢物结构预测、数据库搜索。具体参数设定:质量偏差设定为5×10-6(5 ppm),峰对齐最大保留时间偏移设定为0.5 min,信号强度最大偏差为30%,信噪比(S/N)最大窗口为3,未知物测定保留时间窗口设定为0.2 min,代谢物组成预测信号强度窗口设定为0.1,代谢物组成预测最大质量偏差30%,鉴定数据库为mzCloud与ChemSpider数据库。

利用R语言包对CD软件导出的代谢数据表进行基于QC样品的局部加权非参数回归(LOESS)处理,从而矫正仪器长时间运行导致的保留时间漂移和信号衰减,删除数据表中QC平行样品RSD大于20%的特征峰。将处理后的数据表导入Simca-p软件进行主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)等多变量统计分析。标志物导入Metaboanalyst在线平台进行聚类和鉴别分析。采用多元线性回归模型,利用R语言平台,建立蜂蜜种类(Y)与代谢标志物(X)的线性回归。其中,蜂蜜种类设定为分类变量(麦卢卡设定为1,其他品种设定为0),β值为解释变量X对于因变量Y的偏回归系数。

2 结果与讨论

食品代谢组学已经广泛应用于人参、食用油、葡萄酒、橄榄油和肉类等食品的品种鉴别和原产地区分。利用高分辨质谱技术检测代谢组成分并配合统计学方法进行分析,是一种非常有潜力的蜜源甄别方法。同一蜜源植物由于遗传性有着整体的相似性,因此同一种类的单花蜜在成分上也具有相似性。蜜蜂采集花蜜后,通过自身的酿造,蜂蜜和花蜜只是在糖分组成上发生了变化,而其中的微量成分如来源于蜜源植物中的次生代谢物一般不会发生较大的变化,这为采用代谢组学技术鉴别蜂蜜的种类提供了可能。

2.1 蜂蜜样品前处理条件的优化

样品前处理是代谢组学分析的关键环节。通过查阅文献,实验采用了3种方法对样品进行处理:(1)纯水提取法[16]; (2)甲醇-水(1∶1, v/v)(含1%(v/v)甲酸)提取法[17]; (3)盐酸溶液(pH=2)结合固相萃取法(1.3节方法)。蜂蜜中含有高含量的糖类物质,这类物质在质谱上无法检出,而且会对色谱柱和质谱仪造成一定污染。如图1所示,固相萃取法不但能除掉糖类物质,而且经过HLB固相萃取柱处理后,麦卢卡蜂蜜样品在正、负离子模式下的色谱峰数目均显著增加。因此,最终确定1.3节方法作为最优前处理方法。

2.2 PCA和PLS-DA分析

将采用优化方法得到的代谢物信息导入Simca-p数据分析软件进行后续统计分析,以考察样品的聚类情况。PCA分析表明,在正、负两种扫描模式下,所有混合QC样品的投影点聚类紧密,表明方法的重复性良好并且数据处理过程中未引入任何偏差。麦卢卡蜂蜜均能够与国内典型蜂蜜(油菜蜜、槐花蜜、枣花蜜、百花蜜、荆条蜜、椴树蜜、柑橘蜜)实现很好的区分,说明两者的代谢指纹图谱存在显著差异(见图2)。

将208例蜂蜜作为训练样本(training samples)建立多变量分析模型。与无监督的PCA模式不同,PLS-DA属于有监督模式,能够更好地实现不同种类样品的聚类分析。实验利用PLS-DA建立麦卢卡蜂蜜的鉴别模型,并筛选标志代谢物。如图3所示,x和y分别代表第一主成分(t[1])和第二主成分(t[2]),麦卢卡蜂蜜和其他蜂蜜聚类在各自所属的区域,二者能够得到完全区分,而且置换检验也证明了PLS-DA模型的有效性。在此基础上,可以运用该模型判定测试样品是否为麦卢卡蜂蜜,判定标准是根据样本在模型投影图的位置进行综合评估。如果样品投影在图3的矩形区域内即判定为麦卢卡蜂蜜,换而言之,麦卢卡蜂蜜的判别需要同时满足两个条件:1)正离子模式下,125

图 1 采用不同前处理方法时麦卢卡蜂蜜的总离子流色谱图Fig. 1 Total ion current (TIC) chromatograms of manuka honey using the different preparation methods Method 1: pure water extraction; method 2: methanol-water extraction; method 3: hydrochloric acid extraction followed by solid phase extraction cleanup.

图 2 正离子和负离子扫描模式下蜂蜜样品的PCA结果Fig. 2 Principal component analysis (PCA) results of the honey samples under positive and negative ionization modesQC: quality control.

图 3 正离子和负离子模式下麦卢卡蜂蜜和非麦卢卡蜂蜜的PLS-DA投影图Fig. 3 Partial least squares-discrimination analysis (PLS-DA) score plots of the manuka andnon-manuka samples under positive and negative ionization modes

2.3 代谢标志物

小分子代谢物在蜂蜜蜜种鉴定方面具有至关重要的作用。本研究根据PLS-DA模型的变量权重值(VIP)值大于1、组内偏差较小且非参数检验p值小于0.001的原则获得麦卢卡蜂蜜标志代谢物。mzCloud数据库利用精确相对分子质量以及MS/MS质谱信息进行匹配检索,对差异标志物的质量误差、同位素相似性和碎片离子进行评分。在正、负离子模式下,实验一共筛选得到34个标志代谢物(见表1),利用mzCloud数据库鉴定差异代谢物,MS和MS/MS信息必须完全匹配。实验还利用商品化标准品对芹菜素、栀子甙元、异丹叶大黄素、高香草酸、反式肉桂酸、金雀异黄素6种标志物进行了结构验证。如图4所示,麦卢卡蜂蜜中标志代谢物的含量显著高于其他蜂蜜,这些代谢物则是麦卢卡蜂蜜生物活性的物质基础,而且同一类型代谢物之间存在很强的相关性。

以往的文献[2]表明,麦卢卡蜂蜜主要活性成分是甲基乙二醛(MGO),其抗菌能力很强且活性稳定。MGO在以电喷雾电离源为离子源的质谱中响应不高,虽然实验没有检测出MGO,但是筛选到一些与MGO生物合成和代谢紧密联系的醛类标志物。不法商家经常在普通蜂蜜中添加人工合成的MGO,以仿造麦卢卡蜂蜜,从而谋取暴利。因此,基于MGO含量的传统方法无法对这种掺假行为进行准确判断,但以MGO和醛类标志物组合为目标物进行判断可以增加鉴定的准确度。2017年5月,新西兰Hills实验室发布了Manuka5检测法,包括4种化学标志物(3-苯乳酸、4-羟基苯基乳酸、2′-甲氧基苯乙酮和2-甲氧基苯甲酸)和1种DNA标记物[18]。与单一标志物相比,多种标志物的联合鉴定可极大地提高对麦卢卡蜂蜜的鉴别能力。为了应对Hills实验室的新标准,不法商家除了添加MGO,还向普通蜂蜜中添加了上述化学标记物,因此必须采用高通量技术对样品实现全组成信息扫描。

本研究所用的代谢组学方法可以对数千代谢物进行同时检测,实现整体代谢指纹谱的差异鉴别。如表1所示,实验筛选得到麦卢卡蜂蜜中重要标志物包含了Manuka5检测法中的两个标志物(3-苯乳酸和甲氧基苯乙酮),含量分别比其他蜂蜜中的高近10倍和2.7倍。除此以外,标志物列表中还包括32种其他代谢小分子。实验还在麦卢卡蜂蜜中检测到高含量的二氢麻醉椒苦素,这种代谢物是新西兰特有植物卡瓦卡瓦树的重要成分。因此推测,麦卢卡蜂蜜除了采自麦卢卡红茶树,还有部分采自卡瓦卡瓦树。

麦卢卡蜂蜜中二氢查耳酮含量是其他蜂蜜的9.6倍,这种酮类物质甜度高但能量值较低,具有降低胆固醇和甘油三酯的作用,适合于肥胖患者和糖尿病人食用。与其他蜂蜜相比,麦卢卡蜂蜜还含有高含量的黄酮和肉桂酸类活性物质,这些物质对于健康十分有益。黄酮类化合物具有抗自由基、抗氧化、抗菌、消炎等作用,已经广泛应用于止咳、祛痰、平喘以及肿瘤、心血管等疾病的预防和治疗[19]。肉桂酸类化合物也被众多研究证明具有抗氧化和抑菌活性[20]。因此推测,麦卢卡蜂蜜的优异抗菌效果并不仅仅源于其活性物质甲基乙二醛,高含量的黄酮和肉桂酸类物质也在其中发挥着重要作用。另外,实验发现,麦卢卡蜂蜜代谢标志物列表中包含大量具有抗肿瘤活性的物质,比如芹菜素、黄豆黄素、刺芒柄花素、多花水仙碱等,表明麦卢卡蜂蜜具有在肿瘤预防方面的可能应用潜力。

表 1 麦卢卡蜂蜜的标志代谢物

FC: the ratio of manuka honey group to non-manuka honey group;pvalue:t-test adjusted by false discovery rate (FDR).

图 4 (a)代谢组火山图和(b)代谢标志物热图Fig. 4 (a) Volcano plot of metabolome and (b) heatmap of differential markersM1-M34 were the same as that in Table 1.

进一步分析了代谢物标志物的受试者工作特征曲线(ROC)。曲线下面积(AUC)表示标志物的判别能力,AUC值越接近1,表示判别能力越强。所筛选到的生物标志代谢物AUC值为0.8～1.0,而且绝大多数标志物的AUC值大于0.9,表明它们具有很强的判别能力。标志物组合模型能够提供比单一标志物更强的判别能力。利用在线ROCCET(ROC Curve Explorer & Tester)软件对标志物组合进行了ROC分析,排名前5位的标志物组合的AUC值达到了0.99,表示模型具有很高的准确性和灵敏度(见图5)。进一步建立多元线性回归模型,34个代谢物构建的回归方程校正后的回归系数(r)为0.991 6,说明34个代谢物组合能够很好地解释蜂蜜种类的变化,其中9种标志物对蜂蜜种类鉴别的影响最为显著,按照显著性排名前5位的标志物分别是3-苯乳酸、羟基二氢查耳酮、豆蔻明、羟甲香豆素和3-甲氧基肉桂酸。

麦卢卡蜂蜜是蜜蜂采集麦卢卡红茶树花酿制而成的蜜,因此这些差异代谢物能够反映麦卢卡红茶树与其他蜜源植物的代谢区别。采用Metaboanalyst软件对这些重要标志物的生物通路进行深入分析,发现麦卢卡红茶树的黄酮和黄酮醇生物合成通路显著增强,而这正是麦卢卡蜂蜜区别于其他蜂蜜的生物学基础。

图 5 代谢标志物的ROC分析Fig. 5 Receiver operating characteristic curve (ROC)analysis of the metabolic markers

3 结论

本研究优化了蜂蜜样品的前处理方法,并发展了基于液相色谱-高分辨质谱的代谢组学方法,应用其对麦卢卡蜂蜜和其他主要国内蜂蜜品种进行准确鉴别,建立偏最小二乘法判别模型,对测试样品取得很好的鉴定效果。本研究建立的代谢组学方法为麦卢卡蜂蜜的质量控制提供了新的思路。