南极假丝酵母脂肪酶B在离子液体/超临界流体体系中的稳定性模拟

张静晓，张丽雷*，刘晓洁，吴小亮，徐 璐

1湖北民族学院 生物资源保护与利用湖北省重点实验室，恩施 445000;2湖北民族学院化学与环境工程学院，恩施 445000

南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)具有宽泛的底物特异性、高活性、高对映选择性、以及在水和非水环境中的稳定性，是生物技术中非常重要的酶，在酯交换、动力学拆分和聚合反应中均有广泛应用[1,2]。目前，在离子液体(IL)和超临界流体(SCF)组成的两相体系中进行CALB催化反应是研究的热点[3-5]。在此两相体系中，IL提供催化反应的溶剂环境，能够提高蛋白酶的活性、稳定性和选择性，并且相较于其它有机溶剂更好地保护了蛋白酶的二级结构[3,6-8]；而SCF可降低IL的黏度，促进反应底物的运输，加快反应的进行，并可同时将反应产物从IL相中萃取出来，解决了反应之后需要使用易挥发性有机物进行萃取而产生的污染问题[9,10]。然而，由于IL和SCF形成的两相体系较复杂，IL和SCF的性质以及两相的平衡关系均会影响到蛋白质的结构稳定性，从而影响其活性，因此从原子尺度揭示此两相体系性质对CALB结构稳定性的影响可为开发高效的IL/SCF两相溶剂体系，以及两相体系状态的控制提供重要参考。

分子动力学模拟可以获取在实验中难以获得的空间和时间尺度上生物分子系统的行为和性质[11,12]，是从原子尺度研究溶剂运动对蛋白结构产生影响的有效方法。为了深入理解IL/SCF溶剂体系对CALB蛋白酶结构稳定性的影响，本文采用分子动力学方法，构建了新型离子液体三丁基十四烷基季磷十二烷基苯磺酸盐(CYPHOS IL-201)与无极性的超临界CO2流体形成的两相体系和CYPHOS IL-201与具有较大极性的超临界CHF3流体形成的两相体系，研究CALB在这两种两相体系中的结构和性质，揭示这两种溶剂环境性质对CALB结构稳定性的影响。

1 分子动力学模拟方法

1.1 分子动力学模型的构建

从RCSB PDB数据库中选择CALB蛋白晶体结构(PDB ID：5a71)作为CALB蛋白的模拟模型，此结构是迄今为止分辨率最高的CALB蛋白晶体模型[13]。

构建的典型分子动力学初始模型如图1所示。CALB蛋白晶体置于边长约为11nm的立方体CYPHOS IL-201离子液体相中，离子液体相模型包含880个三丁基十四烷基季磷阳离子和880个十二烷基苯磺酸阴离子，在立方体离子液体相上下位置扩展出5 nm的区域，并置入20 000个超临界流体分子(CO2或者CHF3)，体系约含有20万个原子。模拟过程中采用周期性边界，经等温等压系综(NPT系综)模拟后，体系密度收缩至约为CYPHOS IL-201离子液体密度的实验值。

本文构建了五种溶剂体系，包括：超临界CO2流体(ScCO2)、超临界CHF3流体(ScCHF3)、离子液体CYPHOS IL-201(IL)、离子液体CYPHOS IL-201/超临界CO2两相体系(IL/ScCO2)、以及离子液体CYPHOS IL-201/超临界CHF3两相体系(IL/ScCHF3)。分别对比了CALB蛋白在这五种溶剂体系中的行为和性质。

图1 分子动力学模型Fig.1 The model of molecular dynamics

1.2 分子动力学模拟条件

所有模拟均在GROMACS程序包(版本2016.3)中进行，对CALB蛋白质采用Amber99sb-ildn力场，3点水模型。对离子液体和超临界流体分子采用GAFF力场和AM1-BCC电荷。在IL/ScCHF3两相体系中温度为55 ℃，压力30MPa，其他体系中温度为65 ℃，压力20 MPa。实验研究表明，CALB在此条件下催化活性较好[4]。

对构建的五个体系分别进行三个阶段的模拟，首先采用最陡下降法将每个系统中的溶剂分子进行能量极小化。第二阶段，进行限制性动力学模拟，保持蛋白分子固定，离子液体和超临界流体的分子自由移动，并将体系缓慢加热加压至指定温度和压力条件，使体系密度收缩至约为CYPHOS IL-201离子液体的实验密度值，并达到平衡状态。第三阶段进行平衡状态的模拟，每个系统均采用0.2 fs的时间步长，分别进行20 ns的分子模拟。为了在模拟过程中保持不同组分的恒定温度和压力，使用V-rescale方法控制温度，使用Parrinello-rahman方法控制压力。对于系统的每个组件，应用PME算法估计静电相互作用。

2 结果与讨论

考察了所构建的五个体系在模拟过程中的全体系均方根偏差(RMSD)值，结果如图2所示，从图中可见，经过5ns的模拟后，五个体系均达到了平衡状态。

图2 体系在模拟过程中的RMSD值Fig.2 RMSD values of systems during simulation

图3 CYPHOS IL-201/ScCO2两相体系中的原子数密度分布Fig.3 Atom number density distributions in the CYPHOS IL-201 / ScCO2 two-phase system

为了考查所研究的体系中离子液体CYPHOS IL-201和超临界流体(CO2、CHF3)形成两相的行为，将5ns至20ns范围内，每隔0.1ns取一帧，统计了IL/ScCO2和IL/ScCHF3两个体系中三丁基十四烷基季磷阳离子、十二烷基苯磺酸阴离子、以及超临界流体分子在以CALB蛋白中心为中心，Z轴方向上的原子数量密度分布，并取平均值，结果如图3和图4所示。

图4 CYPHOS IL-201/ScCHF3两相体系中的原子数密度分布Fig.4 Atom number density distributions in the CYPHOS IL-201 / ScCHF3 two-phase system

从图3和图4中可见，CALB蛋白处于离子液体相中，并且没有向超临界液体相移动的趋势。另外，离子液体CYPHOS IL-201中的三丁基十四烷基季磷阳离子和十二烷基苯磺酸阴离子主要分布在CALB蛋白的周围，只有极少部分分布在超临界流体相中。超临界流体分子有少部分进入了离子液体相中，大部分分布在离子液体的周围，与文献报道离子液体和超临界流体的行为一致[14]。此结果表明在所研究的温度和压力下，离子液体CYPHOS IL-201可分别与超临界CO2流体和超临界CHF3流体形成具有相互作用的两相体系。

对比IL/ScCO2和IL/ScCHF3两个溶剂体系的行为可见，离子液体CYPHOS IL-201和ScCO2形成的两相界面较ScCHF3更为明显，说明与ScCO2相比，ScCHF3更容易进入到CYPHOS IL-201离子液体相中，而CYPHOS IL-201也更易分布于ScCHF3流体中。由于超临界流体可以降低离子液体的浓度和黏度，提高反应底物在离子液体相中的运输能力，从而提高酶催化反应的效果，而CHF3具有较CO2更易溶解于CYPHOS IL-201相的能力，从而通过控制温度和压力可能具有更好地提高酶催化反应的能力。

蛋白质原子位置的均方根偏差(RMSD)和时间的函数是反映蛋白质结构稳定性的重要指标15。RMSD是通过蛋白结构与其参考结构的最小二乘法拟合得到，定义如式(1)所示。

(1)

其中，N是体系原子的总数目，ri和ri,ref是蛋白原子分别在考察结构和参考结构中的位置。

图5为CALB蛋白在所考察的五个溶剂体系中运动轨迹的RMSD计算结果。从图中可见，CALB蛋白在ScCHF3流体中非常不稳定，RMSD值变化剧烈，这有可能是因为CALB蛋白在ScCHF3中产生了蛋白质变性[6]。而CALB蛋白在ScCO2流体中RMSD值比较平稳，结构相对稳定，表明具有较大极性的CHF3更容易与CALB蛋白发生相互作用，使其结构发生变化，以致失去催化活性。另外，CALB蛋白在IL、IL/ScCO2和IL/ScCHF3三个溶剂体系中的RMSD值在模拟过程中变化很小，最后上下波动在0.05 nm左右，表现出了良好的稳定性。对比CALB蛋白在ScCHF3和在IL/ScCHF3两相体系中的结果可见，离子液体CYPHOS IL-201起到了稳定CALB蛋白结构的作用，与文献报道CALB在IL/ScCHF3两相体系中可表现出良好的催化活性的结果一致[4]。

图5 CALB蛋白在模拟过程中的RMSD值Fig.5 RMSD values of CALB protein during simulation

蛋白质的均方根波动数值(RMSF)是衡量蛋白质原子在整个轨迹中相对于平均位置波动的程度，计算方法如式(2)所示。

(2)

对CALB蛋白的各个残基在五个溶剂体系中的RMSF值进行了计算，结果如图6所示。从图中可见，CALB在ScCHF3流体中残基波动较大，可能已经发生了蛋白质的变性，与前述RMSD的考查结果一致。CALB蛋白的RMSF值在ScCO2和IL/ScCO2两个体系中最为稳定，表明CO2的存在没有增加CALB蛋白残基的柔性。在IL体系和IL/ScCHF3体系中，CALB蛋白的部分残基表现出了较大的柔性，但是柔性部位并不相同，这是由于CYPHOS IL-201和ScCHF3与CALB蛋白的残基之间产生了相互作用[3,16]。另外，CALB蛋白的催化主要由蛋白中保守的Ser105-Asp187-His224三联体负责[17]。在这四个体系中，这三个残基均未出现明显的波动情况，这也是在这三个体系中CALB表现出良好的催化性能的原因[4]。

另外，对比IL/ScCO2和IL/ScCHF3两个体系中蛋白的RMSF值发现，残基140至150区域内，IL/ScCHF3体系中蛋白的RMSF值发生较大变化，这是由于CHF3与此区域的α螺旋结构发生氢键相互作用，破坏了维持α螺旋结构的N-H…O氢键。CHF3易破坏α螺旋结构从而破坏蛋白结构，设计新型离子液体对α螺旋结构进行保护是提高蛋白稳定性的可行方法。

回转半径(Rg)是描述蛋白质结构平衡构型的重要参数，是蛋白质结构紧密性的重要指标，可用式(3)表示。

(3)

其中，mi是原子i的质量，是原子i相对于蛋白质质量中心的位置。对所研究的五个体系中的CALB蛋白在模拟过程中的回转半径进行了计算，结果如图7所示。

图7 CALB蛋白在模拟过程中的回转半径Fig.7 Radius of gyration values of CALB protein during simulation

从图7中可见，由于CALB蛋白在ScCHF3溶剂体系中可能出现了蛋白的变性，导致其回转半径变得较大。在其他四个溶剂体系中，CALB蛋白的回转半径较小，并且较为接近。其中，CALB蛋白在CYPHOS IL-201离子液体中的回转半径最小，其结构最为紧凑，与前述CYPHOS IL-201离子液体有保护蛋白结构作用的结论一致。在ScCO2体系里，CALB蛋白回转半径有所增大，但并不明显，然而这也有可能会导致蛋白酶催化作用失活。这也可能是文献报道CALB蛋白在ScCO2体系中一段时间后，就出现了催化活性降低的原因[18]。另外，通过对几个体系中蛋白与超临界流体之间的作用力分析发现，蛋白与CHF3之间的静电作用力较CO2的静电作用力大，是影响蛋白稳定性的主要作用力。

图8 CALB蛋白在模拟过程中的二级结构平均含量Fig.8 Average contents of secondary structure of CALB during simulation

为了进一步阐明在所研究的溶剂体系中CALB蛋白酶的构象变化，考查了CALB蛋白酶二级结构在模拟过程中的平均含量，结果如图8所示。从图8中可见，CALB蛋白在ScCHF3溶剂体系中，二级结构出现了明显的改变，表明CALB蛋白可能出现了变性，与前述研究结果一致。另外，CALB蛋白在IL和IL/ScCO2体系中二级结构基本没有发生明显的变化，与文献报道CALB蛋白在这两个溶剂体系中的稳定性良好的结果一致[8,10,12]。

对比CALB蛋白在IL体系和ScCO2体系中的二级结构可见，当酶溶解在ScCO2中时，发生有序二级结构(α-螺旋、β-折叠和转向)和无序二级结构(卷曲)的显著畸变，表明ScCO2对CALB蛋白酶也具有变性作用。有许多实验研究与上述理论研究结果一致。例如，通过圆二色性光谱研究，Ishikawa等人在35 ℃和25 MPa条件下的ScCO2中处理脂肪酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶和葡糖淀粉酶，发现酶中的α-螺旋的含量分别降低62.9%、31.3%、37.6%和12.4%，并且酶的活性还与剩余的活性α-螺旋残基之间存在线性关联[19]。可见蛋白质有序二级结构的减少是蛋白质的活性和稳定性减弱的主要原因，稳定其二级结构可获得较好的活性和稳定性。文献[20]的实验研究也获得了类似的研究结果。在本文所研究的体系中，IL、IL/ScCO2和IL/ScCHF3三个溶剂体系中CALB蛋白的有序二级结构的减少最少，推测其具有最好的活性和稳定性。

3 结论

南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)是生物技术中非常重要的酶。采用离子液体和超临界流体形成的两相体系可为其催化反应提供一个绿色高效的溶剂体系。本文通过分子动力学方法研究了CALB蛋白酶在新型离子液体CYPHOS IL-201分别和具有极性CHF3以及无极性的CO2两个超临界流体形成的两相体系中的结构和性质。结果发现，离子液体CYPHOS IL-201和超临界流体CHF3及CO2均能形成两相体系，具有明显的相界面，CALB蛋白始终处于离子液体相中，具有极性的CHF3分子较无极性的CO2分子更易进入离子液体相，从而降低离子液体相的浓度和黏度。通过对CALB在模拟体系中的RMSD、RMSF、Rg、以及二级结构的分析发现，在超临界CHF3流体中，CALB蛋白发生变性是其失活的主要原因；在超临界CO2流体中，CALB蛋白的结构紧密性降低，有序二级结构减少是蛋白稳定性下降的主要原因。CHF3易破坏维持CALB蛋白α螺旋结构的N-H…O氢键是其导致蛋白结构不稳定的主要因素。离子液体CYPHOS IL-201起到了保护蛋白结构的作用，在离子液体CYPHOS IL-201与超临界流体(CHF3、CO2)形成的两相体系中，CALB蛋白结构较为稳定是其具有较好催化活性的主要原因。通过调整超临界流体分子的极性，一方面保证降低离子液体粘度的程度，另一方面保护蛋白结构的稳定性，有助于获得更好的催化活性。