熊果酸改善自然衰老大鼠糖脂代谢紊乱与自噬能力的研究

赖 颖，马 朋，姚 玲，李海飞2,，袁春琳，李春莉，王建伟*

1重庆医科大学生命科学研究院；2重庆医科大学基础医学院；3重庆医科大学中医药防治代谢性疾病重庆市重点实验室，重庆 400016

伴随生物分子、组织细胞及器官的慢性持续性损伤和功能减退，衰老机体易受疾病侵害而加速死亡[1,2]。早有文献报道在机体衰老过程中胰岛素抵抗和脂质异位沉积等代谢综合症的发生率明显上升，而胰岛素抵抗又被认为是促使肝脏形成脂肪肝的关键因素之一，可促进脂质代谢紊乱，促使过多的游离脂肪酸向肝细胞聚集，进一步加重肝细胞脂肪变，过多游离脂肪酸亦可损伤线粒体,并造成氧化应激，产生大量氧自由基，且脂质沉积和胰岛素抵抗都与自噬有着密切关系[3]。增强自噬可减轻肝脏胰岛素抵抗，降解肝脏内脂滴,减轻炎症反应,改善肝脏糖脂代谢紊乱[4,5]。自噬已成为当前衰老相关研究的潜在突破点，寻找能够通过增强自噬改善衰老相关代谢紊乱的抗衰老药物已成为现代研究的热点。

熊果酸(ursolic acid)是一种广泛存在于天然植物中的五环三萜类化合物，现已证实熊果酸具有抗炎、抗氧化、降糖、改善胰岛素抵抗、调脂、抗肥胖、抗动脉粥样硬化等药理作用，且几乎无其他毒副反应，有望成为抗代谢综合征新药[6,7]。同时近年有文献报道熊果酸能够增强自噬改善肌萎缩，提高代谢敏感蛋白水平进而延缓细胞衰老[8]，亦有文献报道其可以减少脂质沉积从而改善脂肪肝[9]。本研究主要从自噬角度出发,观察熊果酸对自然衰老大鼠胰岛素敏感性和肝脏甘油三酯沉积的改善作用及其对自噬相关蛋白的影响。

1 材料与方法

1.1 动物实验

SD大鼠，雄性，SPF级，青年大鼠3月龄体质量210～230 g，老年大鼠22月龄440～550 g，重庆医科大学实验动物中心提供，动物生产许可证号:SCXK(渝)2015007，常规饲养，实验室温度21.1 ℃，相对湿度55.5%，12 h明暗交替，自由饮水，经适应性喂养1周后开始实验。

1.2 药品及试剂

熊果酸由京都大学Pharmafood研究所馈赠；阿拉伯胶购自上海生物工程有限公司，批号:MC0124B1013J；甘油三酯(TG)和葡萄糖试剂盒购自南京建成生物工程研究所；胰岛素测定试剂盒购自日本森永生科学研究所；油红“O”染色试剂购自德国Sigma公司；LC3A/3B抗体、P62抗体、Beclin1抗体、Drp1抗体、PGC-1α抗体、Pink1抗体购自Cell Signaling Technology；羊抗兔IgG购自博士德生物工程有限公司。

1.3 仪器

匀浆机，德国IAK；酶标仪，日本SANYO公司；电泳仪，美国Bio-Rad公司；光学显微镜，日本Olympus公司。

1.4 分组、模型复制及给药

取22月龄SD雄性大鼠25只，适应性喂养7天后，按平均体质量、禁食状态下血浆葡萄糖、甘油三酯随机分为3组，即老年模型组(9只)，熊果酸高、低剂量组(50，10 mg/kg)(各8只)，另取8只3月龄SD雄性大鼠作为青年对照组，每组均给予正常饮食饮水，每两天记录摄食量，每三天记录大鼠体重。青年对照组和老年模型组分别给予5%阿拉伯胶灌胃，熊果酸组分别将药物溶于5%阿拉伯胶中，按照5 mL/kg灌胃，每日给药1次，连续7周，于实验第7周末称重并处死大鼠，取肝脏称质量，-80 ℃冻存，用于各项指标分析检测。

1.5 生化学指标检测

实验第6周末，所有大鼠禁食过夜，麻醉后于眼眶后静脉丛取血，采用肝素钠抗凝，4 ℃，3 000 rpm，离心15 min，取血浆放入-20 ℃冰箱中冻存备用，使用试剂盒测定血浆葡萄糖、甘油三酯、胰岛素并计算HOMA-IR指数，具体操作严格按照说明书进行。

1.6 肝脏TG检测

称取适量(50～60 mg)肝脏组织，按照组织：异丙醇=100 mg：2 mL比例加入异丙醇，匀浆，4 ℃过夜，离心(3 000 rpm，4 ℃，15 min)，取上清，测定TG含量，具体操作严格按照说明书进行。

1.7 油红“O”染色

取适量4%多聚甲醛固定的肝脏组织，流水冲去多聚甲醛溶液，OCT包埋，冰冻切片8 μm厚度，室温晾干后用于油红“O”染色。在光学显微镜(BX-51，日本Olympus公司)下观察脂滴沉积情况，并拍照(×400倍)。

1.8 Western blot检测蛋白表达

全蛋白提取试剂盒提取肝脏总蛋白，BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度。制备10%分离胶，5%浓缩胶，SDS-PAGE电泳，上样量为50 μg/10 μL，250 mA恒流电转，用5%脱脂牛奶封闭1h，分别加入LC3A/3B，Beclin1，P62，PGC-1α，Drp1，Pink1抗体，4 ℃摇床孵育过夜，TBST 5×10 min洗膜后加二抗(室温孵育2 h)，ECL发光，Image J分析测定各条带的灰度值，内参采用GAPDH。

1.9 统计学处理方法

2 结果

2.1 各组大鼠一般参数

图1A和1B结果显示，与青年对照组比较，老年模型组大鼠摄食量与体质量显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与老年模型组比较，熊果酸低、高剂量组摄食量和体质量无明显差异(P>0.05)，体重亦无明显变化。如图1C和1D所示，与青年对照组比较，老年模型组肝质量和肝重比明显增加，高剂量熊果酸使老年大鼠肝质量降低，肝重比也有下降的趋势。

图1 熊果酸对各组大鼠一般参数的影响Fig.1 General parameters of rats in each 注：食物摄入量(A)，体质量(B)，肝质量(C)和肝重比(D)。#P<0.05代表与青年对照组比较具有统计学差异，*P<0.05代表与老年模型组比较具有统计学差异。Note:Chow intake (A),body weight (B),liver weight (C) and liver weight/body weight ratio (D) in rats. #P<0.05 compared with young normal group,*P<0.05 compared with aging group.

2.2 各组大鼠一般血生化指标

图2所示，与青年对照组比较，老年模型组血浆葡萄糖、TG含量、胰岛素和HOMA-IR指数明显升高且具有统计学意义(P<0.05)；与老年模型组比较，熊果酸高剂量组血浆胰岛素，TG，HOMA-IR指数显著降低(P<0.05)，血浆葡萄糖无明显变化。

图2 熊果酸改善老年大鼠血浆胰岛素敏感性Fig.2 Ursolic acid improves insulin sensitivity in aging 注：血浆葡萄糖(A)，甘油三酯(B)，胰岛素浓度(C)和HOMA-IR(D)。#P<0.05代表与青年对照组比较具有统计学差异，*P<0.05代表与老年模型组比较具有统计学差异。Note:Plasma Glucose (A),plasma triglyceride (B),insulin (C) concentrations,HOMA-IR index (D).#P<0.05 compared with young normal group,*P<0.05 compared with aging group.

2.3 各组大鼠肝脏脂质沉积情况

如图3所示，与青年对照组相比，老年大鼠肝脏TG含量(图3A)和油红O染色面积(图3B)显著增加(P<0.05)，提示随着大鼠年龄的增加其肝脏存在过量的脂质沉积；与老年模型组比较，熊果酸高剂量组明显改善肝脏TG的过量沉积(图3A-3B)，而熊果酸低剂量组没有显著变化。这些结果表明，熊果酸高剂量组比熊果酸低剂量组具有更显著改善肝脏甘油三酯沉积的作用。

图3 熊果酸改善老年大鼠肝脏脂质沉积Fig.3 Ursolic acid alleviates lipid accumulation in liver of aging 注：肝脏甘油三酯含量(A)，油红O染色(比例尺：50μm)(B)。#P<0.05代表与青年对照组比较具有统计学差异，*P<0.05代表与老年模型组比较具有统计学差异。Note:Liver triglyceride content (A),Oil Red O staining area (B).#P<0.05 compared with young normal group,*P<0.05 compared with aging group.

2.4 肝脏自噬相关蛋白的变化

由于熊果酸低剂量组各项指标作用效果均不明显，故在肝脏自噬相关蛋白检测中选取了青年对照组、老年模型组和熊果酸高剂量组。通过western blot分析得出结果如图4，与青年对照组比较，模型组显著降低了LC3B/3A比值及Beclin1蛋白的表达(P<0.05)，熊果酸高剂量组上调了这两种蛋白(P<0.05)，提示老年大鼠肝脏自噬能力明显降低，而熊果酸高剂量组有效地逆转了这一现象。P62蛋白在三组间均没有明显变化。

图4 熊果酸对老年大鼠肝脏自噬的增强作用Fig.4 Ursolic acid enhances autophagy in liver of aging 注：自噬相关蛋白：LC3A/3B(A),Beclin1(B)，P62(C)。#P<0.05代表与青年对照组比较具有统计学差异，*P<0.05代表与老年模型组比较具有统计学差异。Note:Autophagy-related protein:microtubule-associated protein 1 light chain 3 LC3A/3B (A),Beclin1(B),P62(C).#P<0.05 compared with young normal group,*P<0.05 compared with aging group.

2.5 肝脏线粒体受损相关蛋白的变化

与青年对照组相比，老年模型组PGC-1α，Drp1蛋白的表达明显下降，给予熊果酸50 mg/kg治疗7周后，其表达显著升高且具有统计学差异(P<0.05)。这一结果提示老年大鼠肝脏线粒体受损，熊果酸可以改善线粒体受损，提高线粒体质量。

图5 熊果酸改善老年大鼠肝脏线粒体功能Fig.5 Ursolic acid ameliorates mitochondria dysfunction in liver of aging 注：线粒体质量控制相关蛋白：PGC-1α(A)，Drp1(B)，Pink1 (C)。#P<0.05代表与青年对照组比较具有统计学差异，*P<0.05代表与老年模型组比较具有统计学差异。Note:Mitochondrial quality control-r elated proteins:PGC-1α (A),Drp1 (B),Pink1 (C).#P<0.05 compared with young normal group,*P<0.05 compared with aging group.

3 讨论

有研究通过高脂饮食建立了NAFLD大鼠模型同时灌胃给予熊果酸进行干预发现熊果酸能有效降低肝脏TG沉积，改善高脂饮食所致胰岛素抵抗，对NAFLD大鼠肝脏具有保护作用[10]，所以我们猜测熊果酸在自然衰老大鼠中可能具有相同作用。实验结果显示，无论是熊果酸低剂量还是高剂量对老年大鼠的正常饮食体重均没有影响(图1A～B)，排除因熊果酸对其摄食的影响而引起各代谢指标变化。文献报道[11]熊果酸可以降低肝质量与肝重比，但具体机制尚不明确，而我们的实验结果与此一致，即给予熊果酸(50 mg/kg)后明显降低了肝质量，这一现象有待进一步研究。同时与预期结果一致，熊果酸(50 mg/kg)明显降低了血浆胰岛素和HOMA-IR指数，改善了老年大鼠胰岛素敏感性的下降；从肝脏TG检测与油红O染色结果看，在给予熊果酸(50 mg/kg)治疗后肝脏TG沉积明显减少，提示在机体老化中逐步出现了甘油三酯沉积和胰岛素抵抗，在给予熊果酸治疗后显著改善了上述不良现象。

通过查阅文献我们发现，自噬可降解肝细胞内的脂滴改善脂肪肝，从而起到对肝脏的保护作用[12]。自噬发生过程中，微管相关蛋白轻链3(LC3)是诱导自噬发生的关键分子，LC3B是形成自噬体的标志分子，LC3B/LC3A比值与自噬成正相关，可初步判断自噬的发生[13]。同时在自噬发生中Beclin1的表达水平往往会上升，许多自噬调控蛋白通过与Beclin1的不同结构域或氨基酸发生直接或间接结合形成蛋白复合体，进而调控自噬水平[14]。本次研究结果表明，老年大鼠LC3B/LC3A比值显著降低，提示自然衰老过程中肝脏发生自噬的能力减弱，而在给予熊果酸(50 mg/kg)治疗后，其比值明显上升，Beclin1的结果与LC3B/LC3A一致，表明熊果酸可以促进肝自噬的发生。研究显示一个完整的细胞自噬过程包括自噬诱导、自噬体形成及自噬溶酶体的降解。LC3B与Beclin1均是参与自噬体的形成过程，P62则是作为一种参与多种信号转导的蛋白，可连接LC3和泛素化的底物，随后被整合到自噬体中并在自噬溶酶体中被降解，参与自噬体的降解过程，从而形成一个动态的自噬流[15]。自噬发生时，P62水平下降；而自噬受抑制时，P62水平上升。在本次实验中，P62在老年模型组中下降，用药干预后有上升趋势，但无统计学差异，故我们考虑熊果酸是否是通过其他途径进行自噬溶酶体的降解从而改善自噬流完成对受损细胞的清除作用，有待进一步研究。

如前言所述，老化机体易发生胰岛素抵抗、脂质代谢紊乱，过多游离脂肪酸可损伤线粒体，并造成氧化应激，产生大量氧自由基，而细胞的自噬机制逐渐减弱，使损伤的线粒体逐渐堆积，最终又加剧衰老，通过线粒体自噬清除受损线粒体能够抑制细胞的衰老[16]。所以本次实验我们进一步检测了线粒体质量控制相关蛋白PGC-1α，Drp1，Pink1来判断线粒体是否有损伤及熊果酸对其是否有改善作用。PGC-1α是线粒体生成的关键调控因子，可增强核受体及相关转录蛋白的转录活性，刺激线粒体合成和呼吸的发生[17]。结果显示，与青年对照组比较，老年组PGC-1α显著降低，说明线粒体生物发生明显减少，而熊果酸治疗后逆转了这一结果，提高了线粒体质量。同时也有研究发现，和线粒体分裂有关的蛋白质也参与到了线粒体自噬过程中，Drp1是一种与线粒体分裂有关的蛋白[18]，其结果与PGC-1α一致，表明老年鼠线粒体动力减弱，自噬也相应减少，而用药后有了明显的上升趋势。Pink1是一种主要存在于线粒体内膜的蛋白激酶，通过激活Parkin这一E3泛素蛋白连接酶，从而使受损线粒体的阴离子电位通道蛋白VDAC1泛素化，从而启动线粒体的降解过程[19]。本实验结果中Pink1并没有明显差异，提示受损线粒体的清除可能不是通过Pink1-Parkin途径发挥作用。

综上所述，本研究结果表明，在自然衰老大鼠中出现了胰岛素敏感性降低，肝脏脂质沉积增加，线粒体质量损坏，自噬能力减弱，而熊果酸能够改善老年大鼠这些不良现象，提示熊果酸具有改善衰老相关糖脂代谢紊乱和自噬减退的能力。