应用中性粒细胞迁移距离推断损伤时间

刘起清，郭红民，王磊，鲁翰霖，杜秋香，百茹峰，孙俊红，王英元

（1.山西医科大学法医学院，山西 太原 030001；2.太原市公安局迎泽分局，山西 太原 030002；3.中国政法大学刑事司法学院，北京 100040）

损伤时间推断是法医病理学的难点问题之一，其研究方法主要包括形态学、分子生物学等，其中形态学方法具有确凿、稳定、直观可视化等优点。形态分析技术的不断发展，阳性识别和计数，面积分析以及距离分析等功能的丰富，使得形态学分析（包括HE染色、免疫组织化学染色、免疫荧光染色及针对特定细胞的特殊染色等）进行骨骼肌损伤时间推断的研究有了更广阔的前景。

中性粒细胞是组织损伤后早期炎症阶段的重要参与者。损伤早期，在受损部位炎症因子的趋化作用下，中性粒细胞迅速浸润到损伤区，吞噬和清除坏死组织，从而为损伤区组织修复和再生创造条件[1]。因此，中性粒细胞对于早期损伤时间推断具有重要研究价值。

髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）由中性粒细胞特异性合成和分泌，是中性粒细胞的特异性标志物[2-3]。目前中性粒细胞用于损伤时间推断的研究主要集中在炎症细胞数量及比例的时序性变化规律[4]。

本研究通过免疫组织化学染色技术标记MPO以特异性识别中性粒细胞，对中性粒细胞在骨骼肌损伤后的浸润过程进行定性、定位、定量分析，同时应用组织细胞定量分析系统，检测中性粒细胞在早期炎症阶段的迁移距离，并探讨迁移距离在骨骼肌损伤时间推断中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

自由落体肌肉挫伤装置[5-7]。水合氯醛（天津科密欧化学试剂有限公司），一抗为兔抗MPO多克隆抗体（ab9535，英国Abcam公司），二抗使用即用型SABCPOD（小鼠/兔IgG）试剂盒（SA1020，武汉博士德生物工程有限公司），金属增强型二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色试剂盒（AR1026，武汉博士德生物工程有限公司），苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色试剂盒（AR1180，武汉博士德生物工程有限公司），RM2135石蜡切片机（德国Leica公司），TissueFAXS PLUS免疫组织化学分析软件（奥地利Tissue Gnostics公司），4%多聚甲醛溶液、无水乙醇、二甲苯、石蜡均为国产。

1.2 损伤模型制备

健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠20只（购自北京海淀兴旺实验动物养殖场），体质量180～220 g，10～12周龄。将大鼠随机分成对照组和损伤后2、4、6h组，每组5只。损伤组用10%水合氯醛溶液腹腔注射（0.35mL/100g）麻醉大鼠，运用500g重力锤从30cm高的位置以自由落体方式砸击大鼠右后肢骨骼肌，打击面积为6.15cm2（r≈1.40cm），重力势能转化得到的动能为1.5J。对照组麻醉方式同损伤组，但不进行打击[4-5]。损伤后2、4、6h再次以上述方式麻醉大鼠，生理盐水心脏灌注，取挫伤处骨骼肌并观察其形态变化。

本动物实验方法已获山西医科大学科学研究伦理审查委员会批准（伦理审批序号：2016LL151）。

1.3 免疫组织化学染色

将骨骼肌样本置于4%多聚甲醛溶液中固定24h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡完毕后石蜡包埋制成蜡块。使用RM2135石蜡切片机连续切片，厚度3～5 μm，防脱片玻片铺片后60℃过夜。组织切片常规脱蜡至水，过氧化氢消除内源性酶，微波加热修复抗原，5%小牛血清封闭，一抗4℃过夜，即用型SABCPOD二抗孵育，滴加链霉抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物（streptavidin-biotin-peroxidase complex，SABC）液（二抗试剂盒内组分），DAB显色试剂盒显色，HE染色试剂盒复染；梯度乙醇脱水、透明、封片。

1.4 筛选有效细胞核并计数中性粒细胞

利用TissueFAXS PLUS软件获取组织切片高清图片。每个时间点5个样本，每个样本随机选取5张玻片，在每张玻片的损伤区内随机选择5个1mm×1mm分析区，即得到125个样本数据。利用TissueFAXS PLUS软件以苏木素着色强度和着色面积作为参数识别细胞核。实验中设置不同的核面积参数，逐步优化细胞核识别数量，使肉眼可见的细胞核数量识别率达95%以上，并以细胞核数量作为有效细胞核数量，有效细胞核包括骨骼肌细胞核和中性粒细胞核（标识为绿色）。同理，利用TissueFSXS PLUS软件以DAB显色强度和着色面积作为参数识别中性粒细胞（标识为红色）。根据上述结果，系统将自动计数测量区域内的有效细胞核及中性粒细胞数并计算中性粒细胞比例。

1.5 中性粒细胞迁移距离测量

本研究提出基于组织切片计算中性粒细胞至最邻近血管距离的“中性粒细胞迁移距离”简化模型，测量中性粒细胞的平面平均迁移距离，而不考虑其到达损伤区的中间路程。具体测量方法如下：

在选择的分析区内若只有一根血管，则以该血管为原点，检测中性粒细胞与血管间的平面距离作为中性粒细胞的平面距离。若损伤区内有多个血管，可利用分析软件计算每个中性粒细胞分别距离这些血管的平面距离，得到每个中性粒细胞的多个距离，此时以最短距离作为该中性粒细胞的平面距离。最后计算5个样本所有中性粒细胞的平均平面距离作为该损伤时间点的推断特征。

1.6 统计学处理

采用SPSS 20.0软件进行统计分析，利用单因素方差分析比较各组中性粒细胞数及迁移距离的差异。检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 大体观察及HE染色结果

对照组在解剖分离时肉眼可见骨骼肌和皮肤界限较清晰、易分离；镜下见骨骼肌组织排列致密，肌细胞为多核细胞，胞核位于胞膜下，胞质着色鲜红。与对照组相比，损伤后2～6h肉眼可见损伤处骨骼肌肿胀明显，水肿和出血严重，骨骼肌与周围皮肤粘连；镜下见损伤区组织松散，骨骼肌间质内可见血管充盈，中性粒细胞向损伤区迁移，部分血管断裂，骨骼肌细胞排列紊乱，细胞破裂，胞核碎裂、溶解，胞质内及细胞周围可见炎症细胞浸润。

2.2 有效细胞核和中性粒细胞实际阳性率

从图1可知，对照组组织切片中可见大量苏木素着色的骨骼肌细胞核，通过软件设置，骨骼肌细胞核被标识为绿色。损伤后2～6 h，损伤区的中性粒细胞（红色标识）浸润明显，伤后2h中性粒细胞较少，伤后4h最多，伤后6h又减少。

TissueFAXS PLUS软件统计有效细胞核和中性粒细胞结果（图2）显示：对照组有效细胞核的比例为（84.54±6.33）%，损伤后2～6 h，分析区内有效细胞核比例明显下降，伤后2h为（74.87±6.06）%，伤后4h为（71.05±2.04）%，伤后6 h为（51.11±4.68）%。对细胞核进行分析，可见核面积小于42μm2的细胞在对照组中的比例为（15.45±3.12）%，伤后2 h比例为（25.09±3.43）%，伤后4h比例为（28.45±2.02）%，伤后6h比例为（41.97±0.63）%。伤后6h组中，仅苏木素染色强度低于对照组的比例为（7.92±0.91）%，仅核面积小于对照组的比例为（23.09±1.50）%，染色强度低且核面积小的比例为（17.88±1.37）%。

对照组分析区内的中性粒细胞比例仅为（2.50±1.04）%，伤后2h上升至（13.50±1.25）%，伤后4h达到峰值（31.12±2.29）%，伤后6h下降至（14.13±1.42）%。

图1 大鼠骨骼肌组织的MPO免疫组织化学染色结果（×200）

图2 大鼠骨骼肌损伤后有效细胞核和中性粒细胞比例的组织细胞定量分析结果

损伤区域单位面积内有效细胞核及中性粒细胞数量、比例如表1所示。结果表明，骨骼肌组织在未损伤时中性粒细胞极少，在本研究中比例仅为（4.43±0.68）%，但假阳性率使其实际比值有所增加。伤后2h出现中性粒细胞浸润，阳性率为（28.75±0.94）%，之后数量进一步增加，在4 h达到峰值，比例为（45.50±3.63）%，随着炎症过程进展，中性粒细胞浸润程度逐渐降低，至伤后6h其阳性率为（31.92±1.56）%。结合上述数据并划分区间：损伤后2h中性粒细胞实际阳性率＜30%，伤后4 h阳性率＞40%，伤后6 h阳性率为30%～40%。

2.3 中性粒细胞迁移距离

从图3可见，损伤后2～6 h，中性粒细胞逐渐向损伤区迁移：伤后2 h中性粒细胞平均迁移距离为（124.80±12.32）μm，伤后4 h为（229.03±21.45）μm，伤后6h为（335.04±16.75）μm，组间两两比较差异有统计学意义（P＜0.05）。平均迁移距离随损伤时间呈现规律性变化。根据上述数据可划分区间：损伤后2h中性粒细胞平均迁移距离＜200μm，伤后4h平均迁移距离为200～300μm，伤后6h平均迁移距离为300～400μm。

表1 大鼠骨骼肌损伤后有效细胞核和中性粒细胞数的变化 （n=5，±s）

表1 大鼠骨骼肌损伤后有效细胞核和中性粒细胞数的变化 （n=5，±s）

注：各组间数据两两比较，P均＜0.05

中性粒细胞实际阳性率/%4.43±0.68 28.75±0.94 45.50±3.63 31.92±1.56组别对照伤后2h伤后4h伤后6h有效细胞核数/（个/mm2）854.23±59.09 1277.40±102.44 1110.01±82.23 987.03±83.47中性粒细胞数/（个/mm2）38.39±5.46 366.20±38.35 506.77±22.51 312.42±20.13

图3 大鼠骨骼肌损伤后中性粒细胞的有效迁移距离（MPO免疫组织化学染色×100）

3 讨 论

挫伤是日常生活中最常见的一类机械性损伤，其损伤时间推断是法医病理学研究热点和难点之一[8]。损伤时常伴随骨骼肌挫伤，骨骼肌因不容易受外部环境污染、自溶较慢、患病率低、取材方便等，可作为研究损伤时间推断的良好检材[9]。骨骼肌挫伤后，局部可出现红、肿、热、痛和功能障碍。在炎症反应的早期（24h内），中性粒细胞以阿米巴运动的方式首先从血管渗出,并在趋化因子的诱导下向损伤部位定向迁移。有研究[10]报道，骨骼肌损伤后3 h就可分泌血小板衍生因子、成纤维细胞生长因子，趋化中性粒细胞浸润到骨骼肌损伤区，吞噬坏死组织。中性粒细胞具有活跃的吞噬功能，含有酸性磷酸酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶和溶菌酶等，可消化分解吞噬的异物，自身也常坏死，成为脓细胞；且中性粒细胞在静息时就可发生凋亡，3d时凋亡率已达94.3%[11]。有研究[4]显示，骨骼肌挫伤后6～12 h中性粒细胞浸润明显，伤后1 d浸润程度降低，3d明显降低，之后消失。本研究结果也显示,骨骼肌损伤后中性粒细胞阳性率呈现先升高后降低的趋势，且在损伤后2～6h即发现中性粒细胞明显浸润，进一步明确了中性粒细胞浸润时限。人体白细胞浸润一般需要4～6h[12]，本研究发现，大鼠在肌肉挫伤后2h即有中性粒细胞浸润，分析其原因可能为：（1）随着检测仪器和技术的进步，使得原先未被检测到的中性粒细胞得以被检测出来；（2）白细胞浸润时间可能与种属、组织类型、损伤类型、损伤程度等情况有关；（3）大鼠的繁殖能力比人类强、生长速度比人类快，损伤后炎症反应速度可能更快，组织修复能力可能更强。

本研究注意到，与对照组相比，损伤后2～6 h有效细胞核的比例逐渐降低，而苏木素着色面积小于42 μm2的细胞核逐渐增多。这可能与骨骼肌细胞损伤坏死后出现核固缩、核碎裂、核溶解过程有关，导致核面积减小。进一步分析发现，对于伤后6h，不仅苏木素着色面积小于正常值的核增多，着色强度小于正常值的核也明显增多，这说明核固缩、碎裂、溶解与细胞坏死导致苏木素着色能力降低的双重影响共同拉低了该时间点有效细胞核的比例。

中性粒细胞的渗出是一个随时间推演呈现由近及远的动态过程。事实上，这些细胞具体由哪根血管渗出无从知晓，但对损伤时间推断而言并无影响。根据直线距离对中性粒细胞到达损伤区发挥功能有现实意义，我们提出“有效迁移距离”的简化模型，探究其在损伤时间推断上的应用价值。

随着炎症进程的发展，中性粒细胞从血管渗出并向坏死部位定向趋化移动。这种趋化移动表现出明显的规律性，具体体现在炎症早期中性粒细胞迁移距离随时间的规律性变化，损伤后2～6h中性粒细胞平均迁移距离随损伤时间延长不断增加，其吞噬和清除坏死组织的效能随迁移距离逐渐延伸。损伤后2～6h中性粒细胞平均迁移距离随损伤时间的规律性变化，有望用于骨骼肌损伤时间推断的研究，为后续实验提供了新型研究方法。

骨骼肌损伤部位是相对局限的范围，中性粒细胞渗出后发挥效能的区域也应该是以损伤区为主，因此，中性粒细胞在到达目的区域后即停止游走，迁移距离可能不再随损伤时间延长继续增加。基于此种设想，“有效迁移距离”在早期损伤时间推断上具有应用价值，而在晚期损伤时间推断上可能意义不大。后续实验将至少增加损伤后12、24、48h等时间点以丰富早期损伤时间中性粒细胞阳性率和有效迁移距离的数据，优化早期损伤时间推断的时间窗口。本研究发现，中性粒细胞阳性率和有效迁移距离在损伤后2～6 h均呈现规律性变化，且组间差异具有统计学意义，同时结合两者可能更有利于提高损伤时间推断的准确性。当中性粒细胞阳性率＜30%、平均迁移距离＜200μm时，提示大鼠骨骼肌损伤后2h；当中性粒细胞阳性率＞40%、平均迁移距离为200～300 μm时，提示大鼠骨骼肌损伤后4 h；当中性粒细胞阳性率为30%～40%、平均迁移距离为300～400 μm时，提示大鼠骨骼肌损伤后6h。