糖尿病损伤愈合期间中性粒细胞及肌成纤维细胞数量与损伤时间的关系

黄俊杰 ，姚艺 ，夏崇建 ，赵雅頔 ，余思 ，高原 ，叶光华 ，喻林升 ，范琰琰

（1.温州医科大学法医学系，浙江 温州 325035；2.温州医科大学司法鉴定中心，浙江 温州 325035；3.温州医科大学司法鉴定科学技术研究所，浙江 温州 325035）

糖尿病是严重威胁人类健康的代谢性疾病，以2型糖尿病为多见，占糖尿病患者的90%以上[1]。据统计，当今中国人群的糖尿病发病率为11.6%，预计到2030年，全世界的糖尿病患者将达到4.39亿[2-3]。如果糖尿病发病初期未进行有效的血糖控制，持续的高血糖会产生一系列严重的并发症，如糖尿病肾病、心血管并发症、眼部并发症及损伤愈合能力受损等。研究结果[4-6]表明，持续的高血糖会使机体产生代谢记忆。因此，发病初期未控制血糖的严重糖尿病患者难以再通过控制血糖避免糖尿病并发症的出现。研究结果[6]证实，糖尿病斑马鱼在血糖控制到正常范围后其损伤愈合能力受损并未得到改善。

损伤形成时间推断是法医学研究的重要课题。在法医学鉴定中，偶尔会遇到严重糖尿病患者遭受损伤形成创口。由于糖尿病导致损伤愈合能力受损，因此其创口愈合规律不同于正常人。虽然许多指标被证实可用于损伤时间的推断，但糖尿病损伤形成时间的推断未能引起足够的重视。本课题组之前的研究结果[7-8]显示，与正常损伤相比，糖尿病损伤愈合延迟，创口内炎症细胞浸润出现慢且不易消退，而参与损伤修复的成纤维细胞数量减少。基于上述研究现状，本研究选取具有明显高血糖的2型糖尿病DB小鼠及其相同周龄的正常对照小鼠，建立损伤愈合模型，应用免疫组织化学染色技术观察损伤愈合期间的中性粒细胞及肌成纤维细胞的数量，旨在为糖尿病损伤形成时间的推断提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 动物损伤愈合模型的制备及分组

8～10周龄雄性糖尿病DB小鼠（C57BL/KsJ-db/db）及其相同周龄血糖正常的雄性对照小鼠（C57BL/KsJ）购自南京大学-南京生物医药研究院，其中糖尿病DB小鼠从4周龄开始出现持续的高血糖，未控制血糖水平。对照组及糖尿病组小鼠均被随机分为8个损伤亚组和1个未致伤亚组，每组5只。损伤亚组小鼠使用1%戊巴比妥钠溶液腹腔注射（70mg/kg）麻醉后，在背部剃毛、乙醇消毒，使用手术刀片在小鼠背部皮肤正中切割一条长1.5 cm的全层纵向切口。待小鼠复苏后分笼饲养，注意保持创口干燥，避免感染。损伤亚组在伤后6 h、12 h、1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d过量麻醉处死小鼠，取创口及其周围2.0cm×1.5cm大小的皮肤标本进行免疫组织化学染色。未致伤亚组小鼠不进行创口切割，过量麻醉处死后，取相同部位同等大小的皮肤标本进行检测。

本实验经温州医科大学伦理委员会审核通过，符合《实验动物 福利伦理审查指南》要求。

1.2 免疫组织化学染色

小鼠皮肤样本放入由磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）配制的4%多聚甲醛溶液中进行固定，固定后进行冲水、脱水、透明、浸蜡及包埋，用石蜡切片机制成5 μm厚的连续切片。切片烘干、二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱苯、水化，置于3%过氧化氢溶液中室温孵育10min灭活内源性过氧化物酶。切片经抗原修复、室温冷却后，使用牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）室温封闭2 h，滴加兔抗小鼠中性粒细胞（neutrophil）多克隆抗体（1∶300，LS-C348175，美国LifeSpan BioSciences公司）或兔抗小鼠α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）单克隆抗体（1∶1 000，ab124964，英国Abcam公司），保湿盒中4℃孵育12h，PBS洗涤3次，滴加辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的山羊抗兔 IgG（PV-6001，北京中杉金桥生物技术有限公司）室温孵育20 min。PBS洗涤3次，使用二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）试剂盒进行显色，苏木素复染细胞核。另使用PBS代替一抗作为阴性对照，未见假阳性染色。

显微镜下在创口及其周边区随机选取10个高倍视野（×400）进行观察、拍照和分析，统计中性粒细胞（neutrophil阳性细胞）及肌成纤维细胞（α-SMA阳性细胞）在每个视野的平均数量。

1.3 数据处理

数据采用表示，使用SPSS 19.0软件进行统计学分析。采用单因素方差分析进行组间比较，检验水准α=0.05。

2 结 果

与对照组相比，糖尿病组小鼠的创口收缩及愈合延迟。在对照组及糖尿病组的损伤样本中，浸润的多形核细胞显示了neutrophil抗体的阳性反应，表明其是中性粒细胞；在损伤修复期，部分梭形或纺锤形的成纤维样细胞表达α-SMA，表明其是肌成纤维细胞。在对照组及糖尿病组的未致伤小鼠皮肤中，部分血管壁显示α-SMA的阳性染色，未见肌成纤维细胞或浸润的中性粒细胞。

对照组损伤样本中，伤后6h可见中性粒细胞浸润，浸润的中性粒细胞数量于伤后12h达峰值，于伤后3d开始显著减少。糖尿病组损伤样本中，伤后6h仅见少量中性粒细胞浸润，此后浸润的中性粒细胞数量缓慢增多，于伤后5d达峰值，伤后7～10d仍可见较多的中性粒细胞浸润。与对照组相比，糖尿病组创口浸润的中性粒细胞数量在伤后6 h～1 d减少，在伤后5～14d增多。伤后5～10d，糖尿病组创口每个高倍视野的中性粒细胞平均数量大于30，而对照组创口的中性粒细胞平均数量小于20。结果见图1、表1。

对照组损伤样本中，伤后6 h～1 d未见肌成纤维细胞，伤后3d大部分样本的创底边缘可见少量肌成纤维细胞分布，伤后5d所有样本的创底和创腔边缘均可见肌成纤维细胞，肌成纤维细胞数量于伤后7 d达峰值，于伤后14 d显著减少。糖尿病组损伤样本中，伤后6h～3d未见肌成纤维细胞，伤后5d仅2个样本的创底边缘见少量肌成纤维细胞，伤后7d所有样本的创底和创腔边缘均可见肌成纤维细胞，肌成纤维细胞数量于伤后10d达到峰值。与对照组相比，糖尿病组伤后参与修复的肌成纤维细胞数量减少，两组肌成纤维细胞数量在伤后3～7d差异有统计学意义（P＜0.05）。结果见图2、表1。

A：对照组伤后12h；B：对照组伤后5d；C：对照组伤后10d；D：糖尿病组伤后12h；E：糖尿病组伤后5d；F：糖尿病组伤后10d

图2 小鼠创口肌成纤维细胞的免疫组织化学染色结果（×400）

表1 对照组与糖尿病组小鼠伤后各时间点的中性粒细胞及肌成纤维细胞数量（n=5，±s）

表1 对照组与糖尿病组小鼠伤后各时间点的中性粒细胞及肌成纤维细胞数量（n=5，±s）

注：1）与相邻上组比较，P＜0.05；2）与对照组伤后相同时间点比较，P＜0.05

1.1±1.52）22.3±8.11）2）37.2±8.31）15.0±7.61）损伤时间6h 12h 1d 3d 5d 7d 10d 14d中性粒细胞对照组14.5±1.2 42.9±4.31）38.7±5.6 23.5±5.41）15.1±3.61）9.7±2.31）5.2±1.51）3.5±0.9糖尿病组3.7±2.12）11.3±5.81）2）20.5±4.61）2）26.8±5.3 43.2±5.11）2）41.5±4.92）35.1±4.72）15.7±4.21）2）肌成纤维细胞对照组 糖尿病组000 000 4.6±2.81）25.2±5.91）52.7±10.21）46.9±7.5 18.6±7.11）02）

3 讨 论

损伤愈合是一个多细胞、多分子参与的复杂过程，可分为炎症期、增殖期和再塑期3个阶段。炎症反应在创口愈合中起到承前启后的作用，是一把双刃剑。早期的炎症反应对创口愈合是必要的，而持续的炎症反应则会抑制创口修复。在炎症期，中性粒细胞首先浸润至创口，杀灭创口内细菌并清除坏死组织，同时释放趋化因子促进单核-巨噬细胞募集。然后，中性粒细胞发生凋亡，被浸润的巨噬细胞吞噬、清除，这种吞噬细胞移除凋亡细胞的过程称为胞葬。胞葬可促进巨噬细胞从促炎表型转换为促修复表型，使其分泌生长因子，如转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β），进而促进成纤维细胞增殖并分化为肌成纤维细胞，调节创口从炎症期向增殖期过渡[9-13]。

创口内凋亡的中性粒细胞必须被巨噬细胞通过胞葬作用及时清除，否则会继发坏死并释放细胞毒性物质，引起组织二次损伤和持续的炎症反应[14-17]。大量研究[9，13，17-22]提示，糖尿病创口呈现巨噬细胞胞葬功能受损及向促修复表型转换障碍，继而引起创口内过度的中性粒细胞浸润和促炎因子水平增高，并减少抗炎因子和生长因子的表达，最终导致持续的炎症及创口修复迟滞。本课题组前期研究[7-8]结果显示，与正常损伤愈合相比，糖尿病损伤修复后期出现巨噬细胞数量和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）表达的增多，而参与修复的成纤维细胞数量减少，提示糖尿病创口具有紊乱的炎症反应和受损的纤维性修复。

本研究结果显示，在作为对照组的正常损伤愈合样本中，中性粒细胞数量于伤后12h达峰值，于伤后3d开始显著减少。该研究结果与WANG等[23]的研究结果一致，提示正常损伤愈合的中性粒细胞浸润及清除发生较快。此外，与对照组创口相比，糖尿病组创口浸润的中性粒细胞数量在伤后6 h～1 d显著减少，于伤后5d开始显著增多，而伤后5～14d参与修复的肌成纤维细胞数量较少。本研究结果提示，在糖尿病损伤愈合过程中，中性粒细胞浸润发生较慢，而且浸润的中性粒细胞不易被清除，愈合后期过度的中性粒细胞浸润和减少的肌成纤维细胞数量是糖尿病损伤修复的特征。

从法医学应用的角度考虑，结合观察中性粒细胞及肌成纤维细胞可为糖尿病损伤形成时间的推断提供参考依据。本研究结果显示，肌成纤维细胞出现于伤后3～14d的对照组创口及伤后5～14d的糖尿病组创口。伤后5～10d，糖尿病组创口每个高倍视野的中性粒细胞平均数量大于30，而对照组创口的中性粒细胞平均数量小于20。因此，出现肌成纤维细胞且浸润的中性粒细胞数量大于30可作为伤后5～10d糖尿病创口的特征，所有的对照组创口及其他伤后时间点的糖尿病组创口都不具备该特征。再根据肌成纤维细胞的具体数量进一步确定伤后5～10d糖尿病创口的确切损伤时间。

此外，本研究选用的DB小鼠从4周龄开始出现持续的高血糖，未控制血糖水平。因此，对于未进行有效血糖控制的严重糖尿病患者的损伤形成时间推断，本研究的糖尿病组数据可作为相应的参考依据。如果糖尿病患者从发病初期即有效地控制血糖，其损伤愈合可能更接近于正常损伤的愈合。对于法医学实践应用，仍需收集符合上述情况的糖尿病患者损伤样本进一步研究。