小鼠脑挫伤后CB2R的表达变化与损伤时间的关系

陈京伟 ，王鹏飞 ，张孟周 ，张忠铎 ，程浩 ，孙英富 ，温书恒 ，郭相伸 ，赵锐 ，官大威

（1.中国医科大学法医学院 法医司法鉴定中心，辽宁 沈阳 110122；2.智慧检务创新研究院 智慧司法鉴定联合实验室，辽宁 沈阳 110122）

脑挫伤损伤时间推断是法医学研究的重点课题之一。传统的脑损伤时间推断主要依靠脑损伤后的形态学改变。随着分子生物学技术的应用，一些分子生物学指标被证明在脑挫伤后的表达变化具有时间规律性，可以作为推断损伤时间的参考指标，如神经胶质原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、P25、S100 等蛋白[1-2]。这些指标在伤后表达的时间规律不同，表达变化的时间节点不够明确，单一指标难以实现损伤时间的准确推断，因此需要找到更多可用于脑损伤时间推断的指标进行综合判断。大麻素2型受体（cannabinoid type 2 receptor，CB2R）是内源性大麻素系统的重要成员之一，是一种7次跨膜的G蛋白偶联受体，最初被认为只表达于外周组织，参与外周组织损伤后的炎症反应及修复过程[3-4]。本课题组前期研究[5-7]结果表明，CB2R在皮肤和骨骼肌损伤愈合过程中的表达具有时间规律性，可以作为皮肤和骨骼肌损伤时间推断的参考指标。同时，最新的研究结果[8-9]表明，CB2R也表达于中枢神经系统的部分神经元及胶质细胞中，正常条件下CB2R的表达水平较低，然而，其具有很高的可诱导性，在脑挫伤等病理条件下CB2R的表达会迅速发生变化，从而减弱炎症反应，发挥神经保护的作用。上述研究结果提示，脑挫伤后CB2R的表达变化可能与损伤时间具有相关性。因此，本研究拟通过建立小鼠脑挫伤模型，利用免疫组织化学染色、免疫荧光染色及Western印迹技术，检测小鼠脑挫伤后皮质中CB2R的表达变化，探讨其作为脑挫伤损伤时间推断生物学指标的可行性。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

兔抗CB2R多克隆抗体（bs-2377R，北京博奥森生物技术有限公司），小鼠抗β-actin单克隆抗体（TA-09，北京中杉金桥生物技术有限公司），小鼠抗GFAP多克隆抗体（16825-1-AP，武汉三鹰生物技术有限公司），小鼠抗CD68单克隆抗体（ab31630，美国Abcam公司），小鼠抗NeuN单克隆抗体（MAB377，德国Merck公司），Alexa Fluor® 594驴抗小鼠IgG、Alexa Fluor® 488驴抗兔IgG（美国Thermo Fisher Scientific公司），Hoechst 33258染色液（C1017）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（P0009，上海碧云天生物技术有限公司），链霉卵白素-生物素免疫组织化学检测试剂盒（SP-9001，北京中杉金桥生物技术有限公司），驴正常非免疫血清（北京索莱宝科技有限公司），增强化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）试剂盒（美国Millipore公司）。

1.2 实验分组及脑挫伤模型的建立

健康成年（8周龄）清洁级雄性C57BL/6小鼠72只，体质量23～28g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。将小鼠随机分为假手术组和伤后0.5h、1h、3h、6h、12h、1d、3d、7d、14d、21d、28d组，每组6只。

采用腹腔注射2%戊巴比妥钠溶液（30 mg/kg）进行麻醉。头部脱毛、消毒，将小鼠头部固定于立体定位仪上，于头皮正中切开皮肤，切口长2cm，剥离左侧颅顶骨骨膜，在左侧顶骨中线旁1mm处钻一直径4mm的骨窗，暴露硬脑膜并保证其完整性。通过PCI3000精密颅脑损伤撞击器（美国Hatteras Instruments公司）撞击开窗处硬脑膜，撞击硬脑膜的圆柱体截面直径为3 mm，撞击速度为1.5 m/s，深度为1 mm，持续时间为40ms，记录撞击完成时间，消毒，用3M组织胶水粘合头皮切口。假手术组只做颅骨开窗，不进行撞击。

在预先设定时间点注射过量的2%戊巴比妥钠溶液将小鼠处死后，打开胸腔，充分暴露心脏，于左心室缓慢推注磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）50mL，取全脑，沿挫伤区正中冠状切开大脑，一半脑组织提取挫伤区周围2 mm脑皮质用于Western印迹法检测，另一半置于4%多聚甲醛溶液中整体固定后用于组织形态学观察。

本实验操作遵循《实验动物饲养管理和使用指南》。

1.3 免疫组织化学染色

各挫伤组脑组织固定24h后，经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制成组织蜡块，进行连续切片，切片厚度为5μm，切片于37℃烤箱中烤干后室温保存。进行免疫组织化学染色时，先将组织切片进行脱蜡水化及柠檬酸微波热修复，其余步骤按照免疫组织化学检测试剂盒说明书进行，CB2R抗体（1∶1000）4℃孵育过夜，以抗体稀释液作为空白对照。

1.4 Western印迹法检测

将收集的大脑皮质样品置于300μL组织裂解液中，超声细胞破碎仪冰上匀浆破碎。4℃下，以16000×g离心20min，抽取上清液，BCA法测定蛋白浓度，用细胞裂解液将上样蛋白浓度调成一致，-80℃冰箱保存。样品与6×上样缓冲液以5∶1的体积比进行混合，混匀后金属浴变性（100℃，5 min）。20 μg蛋白上样电泳（分别为5%浓缩胶和10%分离胶）2h后用蛋白湿转法将蛋白转印到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，8%脱脂奶粉室温摇床封闭2h，分别加入兔抗CB2R多克隆抗体（1∶2 000）和小鼠抗β-actin单克隆抗体（1∶3000），4℃摇床孵育过夜，次日室温复温30min，用含有聚山梨酯的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐-吐温20（tris buffered saline with tween-20，TBST）洗膜后用二抗稀释液稀释的辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的二抗（1∶3000）室温摇床孵育1h，TBST洗膜，ECL发光并采集图像。

1.5 免疫荧光染色

CB2R分别与神经元（NeuN）、单核细胞（CD68）、星形胶质细胞（GFAP）进行免疫荧光双重染色，观察脑挫伤后CB2R在不同细胞的表达变化。组织切片脱蜡水化及柠檬酸微波热修复后，10%驴血清室温封闭2h，CB2R抗体（1∶400）分别与NenN抗体（1∶300）、GFAP抗体（1∶300）、CD68抗体（1∶200）混合后滴加，4℃孵育过夜后，切片滴加Alexa Fluor®594驴抗小鼠IgG（1∶300）和Alexa Fluor® 488驴抗兔IgG（1∶300）混合液，于保湿暗盒内室温孵育2h。用Hoechst 33258染色液进行细胞核染色。切片经防荧光淬灭封片剂封片，并通过荧光显微镜观察。以抗体稀释液代替一抗作为空白对照。

1.6 图像分析与数据处理

在每张免疫组织化学染色切片及免疫荧光染色切片中于挫伤区周围皮质随机拍摄5个视野（×400），使用Image J软件计数免疫组织化学染色切片阳性细胞（呈棕黄色）数及总细胞数，计数免疫荧光染色切片双阳性细胞数及总细胞数。用Gel Pro凝胶分析软件对Western印迹法检测图像进行灰度值分析，以CB2R与β-actin的灰度值比值作为CB2R的相对表达水平。每组实验在相同条件下至少重复3次。

采用GraphPad Prism 6软件进行统计学分析，所有数据以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 免疫组织化学染色结果

脑挫伤后CB2R阳性细胞率迅速升高，并于伤后12h第1次达到高峰，而后逐渐下降，伤后3d降至最低，之后再次升高并于伤后7d第2次达到高峰，而后再次下降并逐渐恢复至正常水平。伤后0.5h～14d各组小鼠CB2R阳性细胞率与假手术组相比均升高（P＜0.05），其余各组与假手术组相比差异无统计学意义（P＞0.05），伤后7d组CB2R阳性细胞率与伤后12h组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。详见表1、图1。

表1 小鼠脑挫伤后不同时间点CB2R阳性细胞率（n=6，±s，%）

表1 小鼠脑挫伤后不同时间点CB2R阳性细胞率（n=6，±s，%）

注：1）与假手术组比较，P＜0.05；2）与相邻上组比较，P＜0.05

CB2R阳性细胞率14.75±0.88 24.18±2.861）24.70±1.241）29.14±1.191）35.14±0.921）41.88±2.771）29.09±0.891）2）27.74±0.811）47.13±2.201）2）29.21±1.541）2）13.75±2.162）12.42±1.44组别假手术伤后0.5h伤后1h伤后3h伤后6h伤后12h伤后1d伤后3d伤后7d伤后14d伤后21d伤后28d

图1 小鼠脑挫伤后脑组织CB2R的免疫组织化学染色结果（×400）

2.2 Western印迹法检测结果

CB2R在正常脑皮质中表达量较低。脑挫伤后CB2R的相对表达量逐渐升高，并于伤后12 h第1次达到高峰，随后表达量开始下降，于伤后3d其表达量降至最低，随后又开始升高，并于伤后7d再次达到峰值，然后持续下降，于伤后28 d基本恢复至正常水平。与假手术组相比，伤后6 h、12 h、7 d、14 d CB2R的表达差异具有统计学意义（P＜0.05）；除伤后7 d和3 d比较差异有统计学意义（P＜0.05）外，其余各组与相邻上组比较，差异均无统计学意义。详见表2、图2。

表2 小鼠脑挫伤后不同时间点CB2R的相对表达量（n=6，±s）

表2 小鼠脑挫伤后不同时间点CB2R的相对表达量（n=6，±s）

注：1）与假手术组比较，P＜0.05；2）与相邻上组比较，P＜0.05

CB2R相对表达量0.86±0.10 1.04±0.06 1.06±0.12 1.17±0.11 1.32±0.041）1.45±0.161）1.19±0.12 1.15±0.12 1.52±0.131）2）1.27±0.071）1.03±0.20 0.88±0.15组别假手术伤后0.5h伤后1h伤后3h伤后6h伤后12h伤后1d伤后3d伤后7d伤后14d伤后21d伤后28d

图2 小鼠脑挫伤后CB2R在脑皮质中的表达变化

2.3 免疫荧光染色结果

脑挫伤后CB2R阳性神经元、CB2R阳性单核细胞、CB2R阳性星形胶质细胞数与总细胞数的比值变化呈单峰模式。详见表3、图3～5。

表3 小鼠脑挫伤后不同时间点脑皮质不同细胞标记物与CB2R共染的阳性细胞率（n=6，±s，%）

表3 小鼠脑挫伤后不同时间点脑皮质不同细胞标记物与CB2R共染的阳性细胞率（n=6，±s，%）

注：1）与假手术组比较，P＜0.05；2）与相邻上组比较，P＜0.05

CB2R阳性星形胶质细胞0.54±0.06 3.13±0.43 3.82±0.501）5.05±0.881）7.14±0.661）5.26±0.631）5.60±0.841）14.19±0.811）2）21.06±1.251）2）14.02±1.201）2）4.00±0.252）2.16±0.48组别假手术伤后0.5h伤后1h伤后3h伤后6h伤后12h伤后1d伤后3d伤后7d伤后14d伤后21d伤后28d CB2R阳性神经元9.65±0.77 23.88±2.041）25.38±1.381）25.53±2.231）28.74±2.041）38.24±2.301）2）24.16±2.721）2）14.81±1.83 7.07±0.86 9.25±1.11 11.96±0.80 10.77±1.13 CB2R阳性单核细胞0.36±0.12 1.58±0.29 1.95±0.17 3.68±0.391）6.89±1.241）2）9.95±1.201）2）17.92±1.891）2）11.48±0.631）2）2.15±0.292）1.44±0.27 1.23±0.19 0.68±0.20

图3 伤后12h小鼠脑组织CB2R与NeuN的免疫荧光双重染色结果（×400）

图4 伤后1d小鼠脑组织CB2R与CD68的免疫荧光双重染色结果（×400）

图5 伤后7d小鼠脑组织CB2R与GFAP的免疫荧光双重染色结果（×400）

CB2R阳性神经元数与总细胞数的比值于伤后12h达到高峰，且与其他各组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），伤后0.5 h～1 d各组CB2R阳性神经元数与总细胞数的比值均高于假手术组（P＜0.05），其余各组与假手术组比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。

CB2R阳性单核细胞数与总细胞数的比值于伤后1 d达到高峰，且与其他各组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），伤后3h～3d各组CB2R阳性单核细胞数与总细胞数的比值均高于假手术组（P＜0.05），其余各组与假手术组比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。

CB2R阳性星形胶质细胞数与总细胞数的比值于伤后7d达到高峰，且与其他各组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），伤后1 h～14 d各组CB2R阳性星形胶质细胞数与总细胞数的比值均高于假手术组（P＜0.05），其余各组与假手术组比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨 论

脑挫伤是一类常见的颅脑损伤，其损伤机制包括外力作用直接造成组织出血、坏死等原发性损伤以及由此引起的颅内压增高、脑灌注量降低、炎症、氧化应激等因素造成的继发性损伤[10-11]。大量生物分子及多种细胞参与脑挫伤后的组织损伤愈合过程，这些分子及细胞在脑挫伤后的动态变化为法医学损伤时间推断提供了研究基础。随着CB2R在中枢神经系统的表达被证实，其在神经系统中的功能日益受到关注。研究结果[12-13]表明，CB2R与急性脑损伤及慢性神经退行性疾病密切相关。本研究通过免疫组织化学染色及Western印迹技术对小鼠脑挫伤后不同时间点CB2R的表达情况进行检测。免疫组织化学染色结果表明，脑挫伤后CB2R的表达具有时间规律性，脑挫伤后CB2R的阳性细胞率变化呈双峰模式，分别于伤后12 h及伤后7 d两次达到高峰。Western印迹法检测结果表明，CB2R的表达变化趋势与免疫组织化学染色结果一致。免疫荧光染色进一步探究了脑挫伤后CB2R在不同细胞内的表达情况，结果表明，脑挫伤后CB2R在神经元、单核细胞及星形胶质细胞中均有表达，且表达具有时间规律性。

WU等[14]发现药物诱发大鼠癫痫发作后，大鼠海马神经元CB2R表达量显著升高。TANG等[15]研究证明，CB2R激活后可以通过促进受损神经传导通路恢复、诱导神经营养型小胶质细胞的增殖、激活神经营养信号通路等途径发挥神经保护作用。以上研究结果表明，病理条件下CB2R可以发挥神经保护作用。本研究结果显示，在正常脑组织神经元中CB2R弱表达，脑挫伤后神经元中CB2R表达逐渐升高，CB2R阳性神经元数与总细胞数的比值于伤后12h达到高峰，可能解释了CB2R在损伤后第一个表达高峰出现的原因。

脑损伤后中枢神经系统固有炎症细胞（如小胶质细胞）活化，同时募集循环系统中炎症细胞（如多核粒细胞、巨噬细胞等），炎症细胞活化后分泌炎症因子并清除坏死组织[16]。BRAUN等[8]研究发现，脑挫伤后损伤周边区单核细胞CB2R表达上调，激活CB2R促进了巨噬细胞由促炎的M1型向促修复的M2型的极化，从而减轻了炎症反应并改善脑挫伤的预后。炎症反应是神经退行性疾病发病的重要机制之一，帕金森病及阿尔茨海默病等疾病中均证实存在小胶质细胞的活化[17-18]。WU等[19]研究发现，激动CB2R后促进了淀粉样蛋白的清除，抑制小胶质细胞的活化，减轻了神经损伤。本研究结果表明，脑挫伤后单核细胞中CB2R的表达量上调，CB2R阳性单核细胞数与总细胞数的比值于伤后1d达到高峰，提示CB2R可能对单核细胞的生物学功能具有直接的调控作用，进而参与脑挫伤后的损伤愈合过程。

星形胶质细胞是中枢神经系统主要的胶质细胞之一，具有营养、支持、调节炎症反应及瘢痕修复的重要作用。研究发现，在癫痫模型中激活CB2R通过调节PI3K/Akt信号通路促进了星形胶质细胞的活化、增殖，减轻了神经元损伤，从而发挥了神经保护作用[20]。有研究发现，在脑挫伤模型中给予雌二醇可通过激活内源性大麻素受体抑制星形胶质细胞的活化[21]。星形胶质细胞也参与慢性神经退行性疾病相关的炎症反应，TUMATI等[22]研究发现，激活CB2R后抑制了慢性疼痛引起的脊髓星形胶质细胞过度增殖。以上研究结果表明，病理条件下CB2R的激活可能对星形胶质细胞具有双向调节作用。本研究发现，伤后7d CB2R阳性星形胶质细胞数与总细胞数的比值达到峰值，提示脑挫伤后CB2R可能通过对星形胶质细胞生物学功能的调节，调控脑挫伤后组织修复过程，同时也解释了CB2R第2次表达高峰形成的可能原因。

综上所述，脑挫伤后CB2R在神经元、单核细胞及星形胶质细胞中的动态表达提示，其可能通过调节这些细胞的生物学功能参与脑挫伤后组织的炎症反应及修复过程。脑挫伤后CB2R的总体表达及在不同细胞中的表达均具有时间规律性，有望成为法医学实践中脑挫伤损伤时间推断的辅助生物学指标。然而，本研究也具有一定的局限性，未进行相关的人体标本验证，实际案例中脑挫伤后CB2R的表达是否具有时序性有待进一步考证。