基于中药整合药理学平台探讨补中益气汤治疗甲状腺功能减退症的作用机制研究＊

柏力萄，魏 璠，魏军平

（中国中医科学院广安门医院 北京 100053）

甲状腺功能减退症（hypothyroidism，简称甲减）是由于甲状腺激素合成和分泌减少或组织利用不足导致的全身代谢减低综合征[1]。欧洲甲减的患病率在0.2%至5.3%之间[2,3]。美国甲减的患病率在0.3%至3.7%左右[4]。2010年中国十城市甲状腺疾病患病率调查显示甲减的患病率为17.8%[5]。由于社会压力的增大、环境污染加剧、高碘饮食的摄入等因素，甲减的发病率逐年升高，成为影响人类健康的隐患[6]。患者主要表现以代谢率减低和交感神经兴奋性下降为主,临床可出现畏寒、乏力、手足肿胀感、嗜睡、记忆力减退等症状[7]。近几年中医对本病的研究报告在不断增加，中药对甲减的治疗取得一定的效果[8,9]。甲减与中医学“瘿劳”相类似。常由先天禀赋不足、饮食不节、药物所伤、情志失调、劳逸过度等因素引起。病位在颈部，主要涉及肝、脾、肾三脏。脾气虚为甲减发病的主要病机之一。脾气亏损，则症见畏寒肢冷，食少、腹胀、大便溏薄或下肢浮肿，或妇女带下量多，舌淡苔白润脉沉缓无力，临床多以补中益气汤加减。

补中益气汤出自《内外伤辨惑论》（元·李东垣），由黄芪、甘草、人参、升麻、柴胡、当归、白术、陈皮组成，具有补中益气，升阳举陷之功。临床应用和实验研究均表明，经典名方补中益气汤具有改善甲减患者临床症状、体征，减少西药用量，提高患者生活质量等作用[10,11]。补中益气法在甲减心肌损伤的修复中起着重要作用,其机制与其提高心肌α-MHC mRNA的表达、降低β-MHC mRNA的表达有关[12]，并能通过下调Fas、FasL及Caspase-3的表达，降低心肌细胞凋亡指数，对甲减的心肌损害有保护作用[13]。在甲减肾损害动物模型中，补中益气汤能够促进VEGF分泌，VEGF升高对甲减肾损害具有保护作用[14]。自身免疫甲状腺炎是引起甲减的原因之一，补中益气汤可能通过抑制miR-155/SOCS1/STAT3信号通路减少炎症因子释放，从而有效改善自身免疫甲状腺炎免疫失常状态，对甲状腺组织具有保护作用[15]。但目前缺乏对补中益气汤活性成分及其机制的研究。中药整合药理学计算平台（TCMIP，www.tcmip.cn）是以中药方剂数据库、中药材数据库、中药成分数据库、疾病症状靶标数据库为支撑，以人工智能、数据挖掘、网络科学等为手段，从整体角度研究中药复方与疾病间的关联性，能有效地揭示药效物质基础及分子机制，目前广泛应用于中药质量评价、中药临床重定位、中医原创思维揭示、方剂配伍的分子机制、中药新药研发等各个研究领域[16]。为更好地开发经典名方补中益气汤，本研究借助TCMIP筛选其主要活性成分和作用靶点，对于阐明其治疗甲减的分子机制、进一步利用补中益气汤具有十分重要的意义。

1 材料和方法

1.1 补中益气汤化学成分的筛选

通过整合药理学平台V1.0中药材数据库，对补中益气汤中的柴胡、陈皮、当归、甘草、黄芪、人参和升麻进行检索，收集所有药材化学成分，构建补中益气汤化学成分库。

1.2 补中益气汤及甲减症靶标预测

通过整合药理学平台的“中药靶标预测”模块，筛选补中益气汤中化学成分相关的潜在靶点。该平台采用二维结构相似性搜索，结合MACCS分子指纹，并通过OpenBabel软件进行化学指纹特征的提取，基于Tanimoto系数定义的相似度计量方法，与DrugBank数据库中的小分子化合物和FDA上市的药物进行相似性打分，并提取作用靶标。共性靶标越多，说明中药间协同作用可能越强。在平台的“疾病靶标信息”设定界面，以“hypothyroidism”作为疾病或症状关键词进行检索，即可获得甲减的已知治疗靶点，作为候选的疾病靶标。在“中药靶标预测”界面选择相似性分数≥0.8的所有靶标作为补中益气汤的潜在靶标。

1.3 网络构建与分析

基于药物靶标和疾病、症状靶标之间相互作用关系，采用整合药理学平台网络分析模块，构建补中益气汤靶标与甲减靶标网络图，网络通过hub节点连接，以“节点连接度（degree）”的2倍中位数为卡值，选取补中益气汤候选靶标-甲减候选靶标互作网络的核心节点（hubs）；在构建关键节点子网的基础上，以“degree”、“节点紧密度（closeness）”和“节点介度（betweenness）”的中位数为卡值，选取同时满足3个卡值的节点为补中益气汤潜在靶标-甲减靶标相互作用网络的关键节点；进而，通过对上述药物候选靶标所参与的功能和通路进行富集分析，可进一步挖掘补中益气汤治疗甲减的关键网络靶标，及其对应的活性成分和中药，并构建“中药方剂-中药材-化学成分-核心靶标-关键通路-疾病关键病理环节”的多层次网络关联图，明确补中益气汤的作用机制，在整合药理学平台点击网络构建与分析可得到相应的网络图。

表1 “中药-成分-靶标”基本信息

1.4 基因功能和通路富集分析

为了进一步挖掘上述网络计算筛选获得补中益气汤核心靶标的功能，采用整合药理学平台基因本体数据库（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）数据库，提取靶标基因或蛋白质的分子功能（molecular function）、细胞内定位（sub cellular localization）及其所参与的生物学反应（biological process）和通路（pathway），并通过富集计算，针对补中益气汤的关键潜在靶标，进行GO和KEGG分析，将p-value值排名前十的展示在结果中。

2 结果

2.1 补中益气汤所含成分及靶标预测

通过整合药理学平台，君药黄芪收集化学成分29个，预测靶标为77个；臣药人参和甘草分别收集到化学成分158个和133个，预测靶标分别为802个和18个；佐药陈皮和当归分别收集到化学成分46个和65个，预测靶标分别为15个和194个；使药升麻和柴胡分别收集到化学成分为24个和62个，预测靶标分别为9个和351个，补中益气汤中化学成分和靶标总数（表1）。预测靶标前四位的的是人参、柴胡、当归和黄芪。此外，方中共有靶标中共有靶标排名前几位的是人参-当归67个，人参-黄芪57个，人参-柴胡36个，当归-黄芪35个，当归-柴胡24个，柴胡-黄芪23个（表2）。

表2 补中益气汤中单味药材共有靶标分析结果

图1 补中益气汤干预甲减的候选靶标网络

2.2 补中益气汤治疗甲减的核心靶标网络分析

通过整合药理学平台网络分析模块，基于PPI相互作用数据库，构建补中益气汤潜在的靶标与甲减靶标相互作用网络，共筛选出关键靶标631个，根据degree值排序，显示degree值前100个靶点（图1）。其中包含药物靶标71个，疾病靶标3个。从图上可以看出，补中益气汤中筛选的化学成分虽无直接作用的疾病靶点，但三个疾病靶点STAT5A、GATA4和NKX2-1与多个药物靶点相关联，推测补中益气汤可间接作用于疾病的相关靶标来干预甲减。

2.3 关键靶标网络基因GO和KEGG分析

通过GO和KEGG对筛选出的关键靶标进行基因功能和通路分析，结果发现基因功能涉及细胞质基质（cytosol）、线粒体（mitochondrion）、ATP结合（ATP binding）、酶结合（enzyme binding）、蛋白质结合（protein binding）等多个条目，根据P值仅显示前10个条目（表3）。靶标通路富集结果显示其主要几种在嘌呤代谢（Purine metabolism）、内分泌系统（Endocrinesystem）、核苷酸代谢（Nucleotide metabolism）、雌激素信号通（Estrogen signaling pathway）、甲状腺激素信号通路（Thyroid hormone signaling pathway）等信号通路，关键靶标进行基因功能和通路分析时，会富集到大量的生物学过程和相关的信号通路，而P＜0.05表明具有统计意义，由于P＜0.05的生物学过程和相关通路数量较多，因此根据P值的大小进行排序，筛选前十作为代表性生物学过程和通路参考，根据P值仅显示前10个信号通路（表4）。其中ATP结合、酶结合、线粒体氧化应激等与甲减密切相关[17-19]。研究表明甲减期间，星形胶质细胞中的线粒体功能障碍导致从有氧呼吸到糖酵解代谢的代谢转变，在神经元能量供应中起重要作用[20]。此外，代谢组学研究也表明甲减的生物标志物主要涉及嘌呤代谢、氨基酸代谢和能量代谢[20]。关键靶标分析显示补中益气汤治疗甲减可能与能量代谢和嘌呤代谢等多种代谢相关。

表3 补中益气汤治疗甲减关键靶标基因功能信息

表4 补中益气汤治疗甲减关键靶标基因功能信息

图2 补中益气汤治疗甲状腺功能减退症“中药材-核心成分-关键靶标-主要通路”多层次网络关联图

2.4 补中益气汤治疗甲减“关键成分-核心靶标-关键通路”分析

关键通路根据P-value显示前30个通路，这些通路涉及多个方面（图2），如嘌呤代谢、内分泌系统、甲状腺信号通路、核苷酸代谢、碳水化合物代谢等多个通路。这些通路的核心靶标共计63个，与补中益气汤中36个化学成分相关联。网络中补中益气汤中化学成分治疗甲减核心靶标主要集中于ATP家族、ADCY1、AKT1等，这些靶标与能量代谢、内分泌系统和甲状腺激素信号通路等相关。与这些靶点相作用的化学成分有原人参三醇、人参皂苷Rs2、枸橼酸、山奈酚等。相关研究也表明，山奈酚、甘草次酸和人参皂苷类成分可以通过与非雌激素核受体相互作用干扰内分泌系统[21]。

3 讨论

补中益气汤为中医经典名方，临床具有治疗甲减的作用，但由于药味组成复杂，化学成分较多，其作用机制仍未得到阐明。而整合药理学平台以大数据和模型计算为基础，融合人工智能、数据挖掘、网络科学等多学科技术和方法，形成智能化和网络化的功能模块，构建中药多成分与生物活性之间的关联，用以阐明中药药效物质基础及作用机制，为补中益气汤治疗甲减提供了简洁的思路与方法。

本文借助整合药理学平台，分析了补中益气汤治疗甲状腺功能减退症的物质基础及其分子机制，从方中筛选出517个候选成分，预测到1466个作用靶点，其中36个化学成分与63个靶点可能参与了通过线粒体氧化应激、嘌呤代谢、雌激素信号通路、能量代谢内分泌系统等多种代谢途径和信号通路参与了补中益气汤治疗甲减。这些分析结果为进一步研究补中益气汤治疗甲减提供了研究方向，也为临床治疗提供借鉴与参考。整合药理学平台显示补中益气汤可能通过干预STAT5A从而对甲减起到干预作用，而研究表明补中益气汤可以通过调控JAK/STAT信号通路从而保护甲状腺组织，与预测结果相符合[15]。这也提示了重视中药的免疫调节作用可能是治疗甲减的一种思路。

本文借助整合药理学平台，对补中益气汤治疗甲减的化学成分和作用机制进行了分析与预测，但对其分析仅处于计算模拟的水平，后续仍需要进行体内外实验进行相关验证，从而挖掘中药治疗甲减的新思路。