番石榴苷通过激活AdipoR-1/AMPK信号通路减轻大鼠肝细胞瘤H4ⅡE细胞脂质沉积的作用机制研究＊

王 磊，秦灵灵，穆晓红，徐暾海，刘铜华

（1.北京中医药大学第三附属医院 北京 100029；2.北京中医药大学科技处 北京 100029；3.北京中医药大学东直门医院 北京 100102；4.北京中医药大学中药学院 北京 100029；5.北京中医药大学教育部中医养生学重点实验室 北京 100029）

在经济、文化、科技蓬勃发展的当今社会，不健康的生活方式也日益流行。饮食结构不合理、作息时间无规律、缺乏体育锻炼、心理力过大、过度吸烟饮酒，以及生态环境污染等不良因素，使糖脂代谢紊乱飙升，成为世界范围的流行性现象，给患者及其家庭、乃至整个社会造成沉重的负担。其中，高糖高脂、缺乏运动等不健康生活方式导致的脂肪肝等人群占据很大比重。因此，我们在提高人们的健康意识、提倡健康的生活方式的同时，有必要对脂代谢紊乱患者进行早期有效干预。在脂质代谢过程中，肝脏细胞扮演着非常重要的角色，肝细胞脂肪沉积为脂肪肝等疾病发生发展的关键环节，因此，改善肝细胞内脂肪代谢是治疗脂代谢紊乱的重要途径。目前治疗肝脏脂质代谢紊乱的药物以降脂药、保肝抗炎、胰岛素增敏剂、微生态制剂、抗氧化剂等为主[1]，但缺乏特效药物。近年来，中药改善肝脏脂代谢紊乱的优势逐渐显现。

番石榴（Psidium guajava Linn）是桃金娘科（Myrtaceae）番石榴属植物，原产地为南美洲，约17世纪末传入中国，目前主要栽培于华南各地以及四川西南部。番石榴叶为番石榴木的干燥叶及带叶嫩枝，别名那拔叶、番桃叶、鸡矢茶等。实验室对其提取出多种有效成分，包括酚酸类，黄酮类，三萜类，倍半萜类等，动物或细胞实验发现番石榴叶提取物可以不同程度降低体质量、调节脂代谢、胰岛保护、增加肝脏糖原合成、改善骨骼肌胰岛素抵抗、抑制α-葡萄糖苷酶、心肾靶器官保护等作用[2]。其中调节脂质代谢是其重要作用之一。目前对其分子机制、作用通路和具体靶点缺乏深入研究。前期研究发现番石榴叶提取物可以显著降低SHRSP.ZF大鼠体重、降低血清脂联素（Adiponectin，APN）、游离脂肪酸（Free fatty acids，FFA）含量、改善糖耐量，并且可缓解肝脏脂肪蓄积的作用【3,4】。AMPK是细胞内的能量感受器，主要通过调控脂肪、蛋白质与糖合成与转化，维持细胞内能量代谢平衡。现已证明AMPK的活性降低与肝细胞内脂质的堆积密切相关[5]，起关键枢纽作用。近年来，有研究表明番石榴苷是番石榴叶降糖调脂作用的主要成分之一。本实验建立在已取得的研究结果基础上，观察番石榴苷对油酸诱导的肝细胞脂质沉积细胞模型脂质沉积的影响，并且从AMPK为中心，寻找其上下游作用靶点。

1 材料与方法

1.1 实验材料

H4ⅡE大鼠肝癌细胞株（ECACC，Lot No．081015，欧洲），高糖DMEM、胎牛血清(FBS)(GIBCO，美国)，油酸(oleic acid，OA，Nacalai Tesque，日本)；兔抗AMPK抗体、兔抗ACC抗体、兔抗P-AMPK(Thrl72)抗体、兔抗PACC(Ser79)抗体(CST，美国)，Blocking One、p-Blocking One、Striping buffer(Nacalai Tesque，日本)，TG检测试剂盒(Wako，Lot DK.226，日本)，蛋白含量检测试剂盒(Bio-rad，美国)，ECL 发光显色试剂盒(wako，日本)，Compound C(Santacruz，美国)，Sepasol-RNA I Super G(Nacalai Tesque,Kyoto)，ReverTra Ace qPCR RT Kit(Toyobo)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞模型建立方法

将H4ⅡE细胞接种于含有10%FBS的高糖DMEM(4.5g·L-1glucose)培养基的60 mm细胞培养皿中，在37℃、5%CO2环境中培养，细胞生长至90%左右时用0.25%胰酶1：3消化、传代。将40 mmol·L-1的油酸与高塘培养基配制成终浓度为0.2 mmol·L-1的油酸脂质诱导培养基液，将生长至80%-90%汇合的H4ⅡE细胞按照3×105个细胞/ml的密度接种至60 mm培养皿中，约24 h后，待孔中H4ⅡE细胞生长至80%左右汇合时，加入3 mL诱导液，24 h后细胞模型建立，用于后续实验。

1.2.2 细胞生存率的影响

将HEⅡ4细胞接种于96孔板，接种密度为4000个/孔，设为6个组，分别为空白组，不同浓度GAN(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mM)给药组，每组设置5个复孔。各组培养72 h后，每孔加入10 ul的MTT试剂(5 mg·mL-1)，继续培养3 h，每孔加入100 μL的DMSO。在570 nm吸光度下测定各孔OD值，计算细胞生存率=OD检体/OD空白对照。

1.2.3 甘油三酯(TG)测定

分为空白组、模型组、不同浓度给药组（0.05、0.1、0.3 mM）。空白组用低糖培养基培养；模型组、GAN给药组细胞在达到80%左右汇合时，换上诱导液，24 h后，GAN给药组分别加入不同浓度GAN,24 h后收集细胞，使用DCTM法进行蛋白定量，按照GPO·DAOS法测定细胞内甘油三酯。用TG／蛋白含量评估细胞内脂质沉积。

1.2.4 阻滞剂处理

分为空白组、模型组、GAN给药组、及阻滞剂-GAN给药组。空白组细胞一直用低糖培养基培养；模型组、GAN给药组、阻滞剂-GAN给药组细胞在达到80%左右汇合时，换上诱导液诱导24 h，阻滞剂-GAN给药组加0.02 mmol·L-1Compound C处理l h后，与GAN给药组均加入GAN，上述各组细胞继续培养24 h，其后按照1.2.3的方法测定TG／蛋白含量。

1.2.5 Western blotting法检测AMPK、P-AMPK(Thr172)、ACC、P-ACC（Ser79）蛋白的表达量

实验随机分为模型组、GAN给药组（0.3 mM），按照1.2.1方法建立细胞模型后，GAN给药组加入GAN共同培养24 h后取出，在冰上用Homogenized buffer提取细胞内蛋白，分别用10%-12．5%SDS．PAGE分离胶，5%浓缩胶分离蛋白，然后电转移至硝酸纤维素膜上，转移后分别用Blocking One、p-Blocking One封闭30 mim后用1∶1000稀释的兔抗AMPK抗体、兔抗ACC抗体以及兔抗P-AMPK(Thr172)、兔抗P-ACC（Ser79）抗体，4℃过夜后，TBS洗膜3次×10 min后用1∶10000稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗室温振荡孵育1 h，TBS洗膜3次，10 min／次。此后用ECL发光显色试剂盒显影成像，图像经扫描后用NIH ImageJ软件进行光密度分析。计算AMPK的磷酸化水平=P-AMPK(Thr172)/AMPK，ACC磷酸化水平=P-ACC（Ser79）/ACC。

1.2.6 实时荧光定量PCR法检测AdipoR 1、AdipoR 2mRNA表达量

图1 番石榴苷对HEⅡ4细胞存活率的影响（n=5）

图2 番石榴苷对HEⅡ4细胞内甘油三酯的影响(n=3)

图3 -1番石榴苷对AMPK磷酸化水平的影响(n=3)

按照1.2.5方法处理培养细胞后，①提取总RNA：采用Sepasol-RNA I Super G提取总RNA，采用核酸紫外分光光度计检测所获RNA浓度与纯度；②引物序列 ：AdipoR1 forward，TGAGGTACCAGCCAGATGTC；AdipoR1 reverse，CGTGTCCGCT TCTCTGTTACPPAR；内参基因β-actin forward,GGGAAATCGT GCGTGACATT，β-actin reverse,，GCGGCAGTGGCCATCTC；③RNA 的体外反转与Real-Time PCR：经25μL反转录体系，将所得的cDNA加入20μL Real-Time PCR体系，95℃预变性 1min，95℃ 15 s、60℃ 32 s、95℃ 15 s、60℃ 20 s、95℃for 15 s 40个循环(ABI Prism 7000)，用内参基金校正RNA表达量。

1.2.7 统计学方法

采用SPSS 17．0分析软件进行统计分析。计量资料采用均值±标准差(±s)表示，用组间比较用单因素方差分析法（组别数大于等于3），或独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 番石榴苷对HEⅡ4细胞存活率的影响

用MTT法观察番石榴在终浓度为（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mM）时对正常细胞生长的影响。结果显示剂量大于0.3 mM时药物对细胞生长有明显影响（图1）。

2.2 番石榴苷对HEⅡ4细胞内甘油三酯的影响

按照GPO·DAOS法对细胞内甘油三酯测定显示，模型组甘油三脂水平明显高于空白组，具有显著性差异(P＜0.05)；给药组与模型组相比，GAN不同浓度对甘油三酯有不同程度的降低，其中浓度为0.3 mM的GAN给药组与模型组比较具有差异(P＜0.05)。

2.3 番石榴苷对AMPK磷酸化水平的影响

如图3-1、3-2所示，与模型组相比，浓度为0.3 mM的GAN可显著增加AMPK的磷酸化水平(P＜0.05)

2.4 番石榴苷对ACC磷酸化水平的影响

如图4-1、4-2所示，与模型组相比，GAN可显著增加ACC的磷酸化水平(P＜0.05)

2.5 番石榴苷对AMPK阻滞剂Compound C作用后细胞内TG的影响

由图5可以看出，模型组与空白组相比具有显著性差异(P＜0.05)；GAN给药组与模型组比较具有差异(P＜0.05)，阻滞剂-GAN给药组与GAN给药组比较有显著差异(P＜0.05)，即GAN降低细胞内TG含量的作用被AMPK阻滞剂Compound C所逆转。由此说明GAN降低肝细胞脂质堆积模型中TG含量的作用与激活AMPK有关。

2.6 番石榴苷对AdipoR 1 mRNA表达的影响

与模型组相比，GAN可显著增加AdipoR 1mRNA表达量(P ＜ 0.05)（图6）。

图3 -2 番石榴苷对AMPK、P-AMPK(Thr172)表达的影响(n=3)

图4 -1番石榴苷对ACC磷酸化水平的影响(n=3)

3 讨论

胰岛素抵抗(Insulin Resistance,IR)是导致糖脂代谢紊乱的主要因素之一,是多种代谢相关疾病发生的“共同土壤”,如糖耐量减退、高血压、中心性肥胖、血脂代谢紊乱、动脉粥样硬化等。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)信号途径是研究胰岛素抵抗、肥胖、2型糖尿病等代谢性疾病的关键通路。AMPK作为一种重要的蛋白激酶参与机体的多种代谢过程，可调控能量代谢、脂肪代谢、蛋白质代谢、糖代谢等。

AMPK是细胞能量代谢的感受器,其活性受到许多因素的调控。这些因素主要与细胞ATP的消耗和抑制调节有关，由AMP/ATP的比例来控制。AMPK可被5'AMP别构激活以及被磷酸肌酸别构抑制，也可被其上游的AMPK激酶(AMPKkinase inase，AMPKK)激活，两者的作用位点都是AMPK-α亚基172位苏氨酸[6]。AMPK由具有催化作用的α亚基和具有调节作用的β和γ亚基组成。α亚基上的苏氨酸172(Thr172)为AMPK的主要活性位点，当Thr172磷酸化时，AMPK被激活。激活的AMPK可以使下游脂肪酸合成的关键酶乙酰CoA羧化酶(ACC)磷酸化失活，抑制脂肪合成。侯祥红对体外培养的人体肝癌细胞HepG2，添加不同浓度的共轭亚麻酸(Conjugated linoleic acid，CLA)，结果表明随着共轭亚麻酸浓度升高，增加了HepG2细胞的脂质沉积，机理可能是与AMPKα磷酸化水平逐渐下降、伴随乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-CoA arboxylase，ACC)表达水平升高有关[7]。王瑾通过棕榈酸钠和大麻素Ⅰ型受体抑制剂处理Hep-2细胞，发现AMPK磷酸化后,能够使线粒体的氧化作用增强，发挥减脂作用[8]。

图4 -2 番石榴苷对ACC、P-ACC（Ser79）表达的影响(n=3)

图5 番石榴苷对AMPK阻滞剂Compound C作用后细胞内TG的影响(n=3)

图6 番石榴苷对AdipoR 1mRNA表达量的影响(n=3)

除此以外，脂联素(adiponectin，APN)、瘦素(leptin)、运动等也可激活AMPK[9]。APN是脂肪细胞分泌的一种细胞因子,与APN受体(AdipoRs)结合后,激活自身发挥生物学特性。在肝脏中，APN能抑制脂肪酸转运蛋白表达，促进脂肪酸氧化，减少肝糖异生原料[10]。APN受体(AdipoRs)主要有APN受体1(AdipoR 1)、APN受体2(AdipoR 2)两种受体，AdipoR 1在各组织中广泛表达，AdipoR 2主要在肝脏表达。有研究表明高糖状态下，APN与AdipoR 1结合，可以激活下游的靶因子AMPK，并逐级发生反应，增强脂肪酸氧化，减少脂肪在组织中的堆积[11,12,13]。脂联素可以抑制SREBP1c表达，调控肝细胞脂肪合成，可能是通过AdipoR1/LKB1/AMPK通路实现的。也有研究发现脂联素可以激活小鼠肌肉细胞中AMPK及PPAγ活性，同时促进aco、cpt1和fabp3表达量，从而提高肌肉细胞中脂肪氧化水平。对鸡脂肪细胞的研究中发现，可以通过激活AMPK/ACC2通路抑制鸡脂肪细胞的脂肪合成[14]。

番石榴叶味甘涩，性平、入脾、胃、肝、大肠经，有清热解毒、燥湿健脾的功效，在我国民间，常用于治疗糖尿病，肠炎痢疾，创伤出血等疾病。临床上，我国广西和日本均进行过临床对照观察，显示番石榴叶可以明显改善糖调节受损患者的空腹血糖，可显著降低血清胰岛素水平及胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment-insulin resistance index，HOMA-IR)。药理实验研究显示，番石榴叶及其提取物具有调节脂代谢、胰岛保护、增加肝脏糖原合成、改善骨骼肌胰岛素抵抗、抑制α-葡萄糖苷酶、心肾靶器官保护等一系列作用[2]。也有研究[14]发现，番石榴叶提取物可显著降低小鼠腹部脂肪系数、血糖，同时，不同剂量番石榴叶之间存在一定的剂量效应关系。郭翔宇等[2]研究发现番石榴叶提取物可以显著降低SHRSP.Z-Leprfa/IzmDmcr大鼠的体质量。能够通过增加SHRSP.Z-Leprfa/IzmDmcr大鼠骨骼肌脂联素受体(AdipoR1)、AMPK表达,激活下游IRS-PI3K-AKTGLUT4信号通路，促使葡萄糖转运蛋白(GLUT4)从胞浆向细胞膜转运，增加葡萄糖摄取，改善胰岛素抵抗、从而降低血糖。

本课题组前期实验观察番石榴叶提取物对自发胰岛素抵抗肥胖SHRSP/ZF（SHRSP.Z-Leprfa/IzmDmcr）动物模型的作用，结果发现番石榴叶可减低大鼠体重，降低血清中FFA含量，减轻肝脏内脂质的沉积，改善糖耐量。在上述实验结果基础上，本实验以番石榴叶中主要成分番石榴苷为干预因素，从脂质代谢角度出发，观察其对油酸诱导大鼠肝脏细胞脂质沉积细胞模型的作用，并且从AMPK通路，寻找其上下游作用靶点。H4ⅡE细胞来源于大鼠肝癌细胞株，它保留了肝细胞基本的生理特性。故本实验选择油酸诱导的大鼠H4ⅡE细胞建立脂质沉积的细胞模型，首次探讨番石榴苷对H4ⅡE细胞脂质沉积的影响。

本实验给药后，番石榴苷可显著降低脂质沉积细胞模型内TG含量，并且对细胞内AMPK的磷酸化有显著的激活作用，且其降低细胞内TG含量作用可被AMPK阻滞剂所逆转，由此可见番石榴苷改善脂质沉积的作用与AMPK的激活密切相关，进一步观察发现番石榴苷同时具有增加AMPK的下游具有抑制脂肪酸合成作用的ACC的磷酸化，以及AMPK上游AdipoR 1的基因表达的作用，由此可以初步推断番石榴苷可能是通过调节AdipoR 1/AMPK/ACC信号通路，调节肝细胞内脂质沉积的，其具体调节机制有待进一步探索。但本研究对与有关改善脂质代谢紊乱的新药研发具有参考作用。