小茴香中乙酰胆碱酯酶抑制剂的提取工艺

张赟彬 ，许静，魏蒙月*，毛彦佳，万文娟

1. 上海中医药大学公共健康学院（上海 201203）；2. 上海应用技术大学香料香精技术与工程学院（上海 200234）；3. 上海中侨职业技术学院食品学院（上海 201319）

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种导致痴呆、认知功能障碍和记忆力受损的渐进性神经退行性疾病[1]。AD病不仅严重影响患者的健康和生活品质，还给家庭和社会带来相当大的负担。根据已有研究显示，AD的神经性损伤部分归因于胆碱能的干扰，而乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinnesterase enzyme，AchE）抑制剂对乙酰胆碱酯酶起到明显抑制作用，从而控制乙酰胆碱的水平达到AD病的治疗目的[2-4]。目前从天然产物中提取乙酰胆碱酯酶抑制剂已成为开发新型AD药物的研究热点[5-6]。

从香辛料中提取乙酰胆碱酯酶抑制剂是重要的研究方向之一。Cuong等[7]研究发现八角茴香分离物中的萜类等化合物在体外乙酰胆碱酯酶抑制活性测试中表现出明显的抑制作用；Ingkaninan等[8]研究发现甲醇提取的胡椒提取物具有抗乙酰胆碱的抑制活性；而有研究发现胡椒中的胡椒碱可抑制乙酰胆碱从而防止神经受损[9]。我国香辛料资源丰富。小茴香（学名：Foeniculum vulgare L.）是我国人民常用的香辛料，是伞形科的多年生草本植物[10]，在我国广西、内蒙等地区均有广泛的种植。目前对小茴香中乙酰胆碱酯酶抑制剂的研究还鲜见报道。试验以广西小茴香为原料，通过单因素试验结合正交试验对提取工艺条件进行优化，为实现小茴香中乙酰胆碱酯酶的高效提取打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小茴香（产地广西），市售；乙酰胆碱酯酶（500 U/2 mg）、硫代乙酰胆碱、二硫二硝基苯甲酸、十二烷基硫酸钠，美国Sigma公司；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化镁、乙醇、甲醇、石油醚，均为分析纯，上海泰坦科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

ME 204 E电子天平，托利多仪器上海有限公司；DK-S 24恒温数显水浴锅，常州翔天实验仪器厂；EMS-20磁力搅拌油浴锅，乔跃电子上海有限公司；KQ-50 DE超声波清洗仪，昆山市超声仪器有限公司；UV-1800紫外可见光光度计，岛津中国有限公司；BUCHI R-2真空旋转蒸发仪，Buchi实验室设备贸易上海有限公司。

1.3 方法

1.3.1 AchE抑制活性测定方法

采用改进的Ellman’s方法[11]。在样品测试组中，试管中依次加入2 900 μL pH 8.0的PBS缓冲溶液、20 μL 1.0 U/mL AchE和100 μL 1.0 mg/mL的小茴香提取液，振荡混匀后将试管置于37 ℃水浴锅预热2 min，然后将50 μL 15 mmol/L DTNB溶液和50 μL 15 mmol/L ATch溶液依次加入试管中，振荡混匀，在37 ℃下水浴20 min，最后加入1.0 mL 4% SDS以停止反应，在波长412 nm处快速测定吸光度。在测定中，对照组使用100 μL 10%乙醇溶液代替10 μL 1.0 mg/mL的样品提取液，记作A对照。在空白组中，使用100 μL的PBS缓冲液代替100 μL小茴香提取液，记作A空白。在样品本底组，用20 μL的PBS缓冲液代替20 μL的0.1 U/mL AchE，记作A本底。按式（1）计算抑制率。

1.3.2 小茴香AchE抑制剂提取单因素试验

1.3.2.1 小茴香不同溶剂提取液的制备

采用回流法提取小茴香中乙酰胆碱酯酶抑制剂。称取10 g小茴香粉末加入120 mL不同溶剂（乙醇、甲醇、石油醚、蒸馏水）中，提取温度70 ℃、回流提取时间100 min，抽滤，旋转蒸发（90 mbar，45 ℃，20 r/min）后提取液用10%乙醇稀释至1.0 mg/mL，备用。

1.3.2.2 小茴香不同乙醇体积分数提取液的制备

采用不同乙醇体积分数（60%，70%，80%，90%和100%）提取小茴香中乙酰胆碱酯酶抑制剂，其余同1.3.2.1小节，制得提取液。

1.3.2.3 小茴香不同提取时间提取液的制备

称取10 g小茴香粉末加入120 mL 75%乙醇溶液中，提取温度70 ℃、回流提取时间分别为60，90，120，150和180 min，其余同1.3.2.1小节，制得提取液。

1.3.2.4 小茴香不同温度提取液的制备

采用不同提取温度（55，65，75，85和95 ℃）提取小茴香中乙酰胆碱酯酶抑制剂，提取时间120 min，其余同1.3.2.3小节，制得提取液。

1.3.2.5 小茴香不同料液比提取液的制备

在不同体积（90，120，150，180和210 mL）含75%乙醇的溶液中加入10 g小茴香粉末，得到不同料液比（1︰9，1︰12，1︰15，1︰18和1︰21 g/mL）的提取液，采用提取温度50 ℃、回流提取时间120 min回流提取条件，其余同1.3.2.3小节，制得提取液。

1.3.3 小茴香AchE抑制剂提取正交试验

依据单因素试验结果，选取料液比、提取时间、提取温度和乙醇体积分数四个影响较大的单因素及相应水平设计L9(43)正交试验进行工艺优化，因素与水平见表1。以小茴香提取液中AchE抑制率为指标，优化出小茴香中乙酰胆碱酯酶抑制剂提取的最佳工艺条件。

表1 正交试验因素与水平

以正交试验所确定的最佳工艺条件对小茴香进行乙酰胆碱酯酶抑制剂的提取，验证比较AchE抑制率。

2 结果与分析

2.1 小茴香乙酰胆碱酯酶提取工艺的单因素试验

2.1.1 不同溶剂的小茴香提取液对AchE抑制率的影响

由图1可知，在利用不同溶剂提取小茴香中乙酰胆碱酯酶抑制剂的试验过程中，当以乙醇作为提取溶剂时小茴香提取液中AchE抑制活性成分含量最高，抑制率效果最好，其次为以水作为提取溶剂，可见小茴香中AchE抑制活性成分易溶于乙醇和水中。因此，在后续试验中测定不同体积分数的乙醇水溶液对提取小茴香中AchE抑制剂的影响。

图1 不同溶剂的小茴香提取液对AchE抑制率的影响

2.1.2 不同乙醇体积分数的小茴香提取液对AchE抑制率的影响

由图2可知，小茴香提取液中AchE抑制率随乙醇体积分数的增加而增加，并且在乙醇体积分数为75%时达到了最大AchE抑制率水平，随乙醇体积分数的进一步升高却呈下降趋势。表明小茴香中含有的抑制AchE的活性成分物质有部分易溶于水中，有部分易溶于乙醇，当乙醇体积分数为75%时，两者的总提取量达到最大。因此，在后续试验中选定提取溶剂为75%乙醇溶液。

图2 不同乙醇体积分数的小茴香提取液对AchE抑制率的影响

2.1.3 不同浸提时间的小茴香提取液对AchE抑制率的影响

由图3可知，随着浸提时间的延长，小茴香提取液中AchE抑制率随提取时间的增加而增加，当提取时间为120 min时，抑制效率最高，抑制效果最好；而加热回流时间继续延长，抑制率反而下降，可能是由于加热促进有效成分的溶出，但加热时间太久也可能导致小茴香提取液中抑制AchE类有效成分部分失活。考虑实际过程中提取效率和节约能源，最终确定后续试验中浸提时间为120 min。

2.1.4 不同提取温度的小茴香提取液对AchE抑制率的影响

由图4可知，随着温度的升高，小茴香提取液对AchE抑制率不断提升，在75 ℃时抑制率为最大，继续升高温度使得AchE抑制率反而下降。原因可能是小茴香提取液中AchE抑制剂类化合物的溶解度随温度的升高而释放和溶解，在75 ℃时溶出最多，但过高温度也会导致小茴香提取液中某些抑制剂活性成分化合物的降解。因此，后续试验选定浸提温度为75 ℃。

图3 不同浸提时间的小茴香提取液对AchE抑制率的影响

图4 不同提取温度的小茴香提取液对AchE抑制率的影响

2.1.5 不同料液比的小茴香提取液对AchE抑制率的影响

由图5可知，提取溶剂的体积从90 mL增加到120 mL后，提取率有明显上升，但溶剂量的进一步增加对小茴香提取液中AchE抑制剂的提取没有提升反而下降。考虑到AchE提取效率和生产成本，最终确定后续试验中料液比为1︰12 g/mL。

2.2 小茴香乙酰胆碱酯酶抑制剂提取工艺的正交试验优化结果

在单因素试验基础上获得了各工艺条件最佳参数，以AchE抑制率为指标，对影响抑制率最重要的4个因素进行L9(34)正交试验，试验设计及结果见表2。

由表2可知，各因素对小茴香中AchE抑制剂的提取影响效果顺序为C＞D＞B＞A，提取温度对小茴香中AchE抑制剂的提取效果影响最大，第二因素是提取时间、乙醇体积分数，采用合适的乙醇体积分数提取会使小茴香提取液中AchE抑制率上升。浸提时间对提取的有效成分影响效果较弱，料液比对小茴香中AchE抑制剂的提取基本无明显影响。综上所述，小茴香中AchE抑制剂提取的最佳条件为A1B3C2D3，即浸提温度为75 ℃，乙醇体积分数为85%，浸提时间为150 min，小茴香与溶剂体积比为1︰12 g/mL，AchE抑制剂的提取效率最优。

图5 不同料液比的小茴香提取液对AchE抑制率的影响

表2 小茴香AchE抑制剂提取正交试验设计及结果

2.3 验证试验

由表2可知，在正交试验最优化提取方案中小茴香中AchE抑制剂提取最优组合为A1B3C2D3，而单因素试验中小茴香中AchE抑制剂提取最优组合为A3B1C2D3，对两种工艺条件进行试验，结果如表3所示。考虑到节约成本、低耗能高提取效果的原则，综合确定最优提取方案为A1B3C2D3，得到小茴香提取液中乙酰胆碱酯酶抑制率为57.543%。

3 结论

通过正交试验设计及验证试验，确定出小茴香中乙酰胆碱酯酶抑制剂提取的最佳工艺：85%的乙醇作为提取溶剂，料液比1︰12 g/mL，在提取温度为75 ℃下回流提取150 min。在最佳工艺条件下小茴香提取液中乙酰胆碱酯酶抑制率达到57.543%。

试验建立了回流提取法制备高AchE抑制活性的小茴香提取物的最佳提取工艺，为实现小茴香中乙酰胆碱酯酶的高效提取打下基础。