离子液［Bmim］Br中β-葡萄糖醛酸苷酶催化甘草酸选择性水解*

陈桂玲 张玉然 张 晓 朱友双 赵全义

（1 济宁医学院生物科学学院 山东日照 276826 2 兰州大学药学院 甘肃兰州 730000）

甘草酸（GL）可以被β-葡萄糖醛酸苷酶催化选择性地水解为单葡萄糖醛酸甘草次酸（GAMG），GAMG 作为甘草酸的衍生物，具有较甘草酸更为显著的抗癌、抗炎等药理作用，其极性适中，更易被人体吸收，生物利用度高。此外，GAMG 还可作为一种新型的天然甜味剂，在医药和食品工业领域具有重要的研究价值［1-3］。 目前对GAMG 的制备及研究主要集中在生物转化方面， 即利用甘草酸水解制备GAMG，其中常用的溶剂为磷酸缓冲液，但在实际生产中具有转化效率低、产物不稳定等缺点［4］。 近年来，对新型有机溶剂反应体系的开发成为甘草酸选择水解制备GAMG 的研究热点。

室温离子液体（room temperature ionic liquid，IL）是指由离子构成且在常温下呈液态的化合物，由于其具有促进反应速率、提高反应选择性、实现反应过程的绿色化等优势，作为绿色高性能反应介质已经得到人们越来越多的关注，近年来许多生物催化反应已经成功地在离子液体系中实现［5-7］。

本论文选择2 种不同的离子液体系，1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐（［Bmim］PF6）与1-丁基-3-甲基溴化咪唑（［Bmim］Br），并利用从鸭肝中粗提取得到的β-葡萄糖醛酸苷酶进行催化反应， 探讨离子液体系中甘草酸的选择性水解反应特性。为建立高效的β-葡萄糖醛酸苷酶选择催化甘草酸生成GAMG 的反应体系提供一定的理论依据，提高GAMG 的产率，更好地服务于医药和工业生产。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 甘草酸（甘肃兰特植物化学品有限公司）、酶溶液（自制）、离子液［Bmim］PF6与［Bmim］Br（兰州生物化工有限公司）、磷酸缓冲液（pH=6.0）、丙酮（AR）、色谱甲醇、乙酸乙酯（AR）。

1.2 仪器与设备 高效液相色谱仪（Waters 600泵、2998 型PDA 紫外-可见检测器、2414 型柱温控制系统、2707 型自动进样系统，美国Waters公司），色谱柱为SunFire C18（4.6×150 mm，5 μm，Phenomenex Inc.， Torrance，CA，美国）、组织匀浆机、Discovery 十万分之一天平、紫外-可见分光光度计（PekinElmer Lambada 25）、台式冷冻离心机（Hermle Labortechnik GmbH Z36HK）、RE-52A 型旋转蒸发仪、79-3 型恒温磁力搅拌器。

1.3 实验方法

1.3.1 β-葡萄糖醛酸苷酶的制备 取新鲜鸭肝，除结缔组织后剪碎，制备组织匀浆，用-20℃预处理的丙酮、乙醚抽提除脂类，真空干燥除去有机溶剂，将得到的酶干粉溶于磷酸缓冲液 （PBS，pH=6.0），进行差速离心（分别以1 500× g 离心30 min，12 000× g 离心20 min，28 000× g 离心10 min），收集上清液置于60℃水浴锅中热变性10 min，离心除去沉淀;上清液中加入硫酸铵至50%饱和度盐析,透析除盐，最终得到β-葡萄糖醛酸苷酶的粗酶溶液。

1.3.2 β-葡萄糖醛酸苷酶在离子液中的催化反应向3 mL 的溶剂反应体系中加入0.0082 g 甘草酸及2 mL 自制酶溶液，于55℃磁力搅拌加热反应。2 h 后酸化终止反应，然后向每个试管中加入5 mL乙酸乙酯进行多次反复萃取，合并萃取液进样高效液相检测。 对离子液浓度、底物浓度及反应时间进行探讨，除控制变量之外，反应条件同上。

1.3.3 酶活力的测定方法 反应进程通过高效液相进行检测。流动相为甲醇∶水∶乙酸=75∶25∶5,流速为0.8 mL／min，进样量为10 μL，检测波长为254 nm。

产率的计算方法为产物GAMG 的峰面积与检出峰总面积（包括反应底物甘草酸GL 的峰面积与反应产物GAMG 或者最终产物甘草次酸GA的峰面积总和）的比值乘以100%。

在离子液［Bmim］Br 中β-葡萄糖醛酸苷酶可以把甘草酸选择性地催化水解为GAMG。高效液相跟踪酶催化的甘草酸水解反应进程如图1 所示。

2 结果与分析

2.1 溶剂效应 选取H2O、［Bmim］Br、 乙酸乙酯（ethyl acetate）、PBS 缓冲液 （pH＝6.0）、［Bmim］PF6共5 种不同反应溶剂作为反应介质。 结果如图2所示， 反应2 h 后， 不同溶剂系统中GAMG 的产率差异比较显著。 其中以0.05 mol/L 的离子液［Bmim］Br 中产率最高，为78.38%，比PBS 缓冲液高近10%；而另一种离子液［Bmim］PF6反应进程较慢，仅为28.45%。其原因可能是［Bmim］Br 为一种亲水性的离子液，与PBS 缓冲液相比较，它的溶剂极性较强， 更易于极性分子底物甘草酸的溶解，而［Bmim］PF6是疏水性的离子液，甘草酸不容易在此离子液中溶解。

有研究报道［8-9］，离子液会导致酶蛋白的构象发生变化，使其活性降低或者丧失，进而影响反应进程，这可能是2 种离子液中产率显著不同的原因。 为了对此进行验证，通过紫外光谱法对不同溶剂对酶蛋白的影响作出探讨。 结果如图3所示，β-葡萄糖醛酸苷酶在［Bmim］Br 中紫外吸收（曲线d）较其他溶剂发生了明显变化，最大吸收峰值为236.8 nm，而在水中为193.6 nm，表明酶的特征吸收峰在离子液中发生比较明显的红移。 ［Bmim］Br 中较强的紫外吸收表明β 葡萄糖醛酸苷酶可能在该离子液中得到高度的分散，几乎是以单个分子的形式存在，这种高分散度的构象分布有利于酶与底物的相互作用，促进了反应的进行。

2.2 离子液浓度效应 如图4 所示， 在［Bmim］Br的低浓度范围（0.01～0.06 mol/L）内，甘草酸水解生成GAMG 转化率相对较高，且反应速率随离子液浓度的增高而呈线性上升，当［Bmim］Br 的浓度为0.06 mol/L 时，GAMG 产率最高。 但当［Bmim］Br的浓度超过0.06 mol/L 时，反应速率急速下降。这可能与高浓度的离子液粘度太大， 不利于溶质分子的扩散，抑制了反应进程有关。对［Bmim］PF6而言， 在0.02 mol/L 到0.5 mol/L 的浓度范围内，酶催化甘草酸水解生成GAMG 的产率都相对较低而且变化不大， 说明β-葡萄醛酸苷酶在离子液［Bmim］PF6中活性受到限制， 该离子液不适合作为甘草酸水解反应的共溶剂。

2.3 底物浓度效应 结果如图5 所示,当[Bmim]Br的浓度一定时（0.06 mol/L），在甘草酸浓度为0.51～6 mmol／L 的范围内，GAMG 产率随底物浓度升高而下降。 底物浓度为0.5 mmol／L 时，反应40 min后甘草酸的水解转化率为85.16%， 但当甘草酸的浓度高达4 mmol／L 时， 该反应速率急剧下降，仅有5.41%的产物生成。 结果表明，低浓度的甘草酸可以提高离子液中水解反应的转化速率。可用反应性与选择性的原则解释，高浓度的底物会促进反应正方向的进行，但是同时也会降低底物与催化酶之间的立体选择性，从而对具有空间选择性要求的该水解反应产生抑制。

2.4 温度效应 如图6 所示， 在低温范围内，2种溶剂中的反应速率均随温度升高而上升。 但在相同低温范围内，［Bmim］Br 中水解反应速率比PBS 缓冲液中高， 说明低温条件下，β-葡萄糖醛酸苷酶在该离子液中也具有较好的催化活性。［Bmim］Br 中β-葡萄糖醛酸苷酶的最适反应温度为45℃，较PBS 缓冲液降低了10℃。 在PBS 缓冲液中，当反应温度超过70℃时，酶的活性迅速降低，最多有10%的甘草酸实现水解，而在离子液［Bmim］Br 中，β-葡萄糖醛酸苷酶的热稳定性更强，反应温度为75℃时，产率仍高于50%，说明离子液中酶的稳定性得到提高。

2.5 反应进程及产物的稳定性探讨 GAMG 只是甘草酸水解反应的中间产物， 随着反应进行，β-葡萄糖醛酸苷酶可继续催化最终生成甘草次酸（GA）。对反应进程进行探讨，结果如图7 所示，在［Bmim］Br 中，甘草酸可以在5 h 内完全转化生成GAMG，且无副产物GA 生成。 这与早期研究报道［10-11］通过甘草酸选择水解制备GAMG 的结果相比较具有很大优越性，反应速率的提高，极大地缩短了完全转化所需要的反应时间。

从图7 中还可看出，6 h 后，反应系统中开始有最终水解产物GA 检测到， 但产率一直维持在较低水平，表明在［Bmim］Br 中，β-葡萄糖醛酸苷酶已催化GAMG 水解掉1 分子糖醛酸生成GA，但由于离子液的微粒子溶剂环境使酶具有较好的立体选择性， 更加倾向于选择性地催化甘草酸中β-糖苷键的水解而不是催化单葡萄糖醛酸的水解或者甘草酸的2 步水解， 这就使得即使甘草酸已经在5 h 内完全实现了第1 步水解转化（GLGAMG），24 h 内酶催化进行第2 步水解（GAMGGA）的反应速率也极大受到限制，从而保证了产物的稳定性，利于GAMG 的回收分离。

3 结论

在离子液［Bmim］Br 中，β-葡萄糖醛酸苷酶可以高效、定向地催化甘草酸进行选择性水解，生成单葡萄糖醛酸甘草次酸。 β-葡萄糖醛酸苷酶在该离子液中活性及热稳定性都能得到一定程度的提高。 当离子液［Bmim］Br 浓度为0.06 mol/L，反应温度为45℃时， 在β-葡萄糖醛酸苷酶的催化下， 反应5 h 后甘草酸可以被完全转化生成单葡萄糖醛酸甘草次酸。这表明从鸭肝中纯化制备β-葡萄糖醛酸苷酶，并以离子液［Bmim］Br 作为反应共溶剂制备单葡萄糖醛酸甘草次酸， 可作为一种高效的反应制备体系，其具有一定的应用前景。