机械加载减轻骨关节炎小鼠的病理进展

于咏，李心乐，2，刘大全，2，张平，2△

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是常见的慢性疾病之一。据统计，OA影响了全世界约6.3亿人［1］，无论是在发达国家还是发展中国家，OA都造成了巨大的经济负担［2］。以前认为OA是一种软骨退化的疾病，但现在认为是一种全关节的病变［3］。滑膜炎和骨赘形成分别是OA 早期和晚期的典型病理变化。软骨的退化可以促进滑膜的炎症反应，滑膜炎也可以促进软骨的退化［4］。骨赘是软骨破坏后产生的新骨［5］，它来自于骨膜和滑膜［6］。

OA 的治疗包括药物治疗和非药物治疗。口服药物只能在一定程度上缓解疼痛并且带来很多不良反应。关节置换术只适用于晚期患者，并且假体的寿命以及炎症反应等均使其存在一定的局限性［7］。而物理康复治疗作为一种新型的治疗方式越来越引起广泛的注意。本课题组自主研发的脉冲式关节机械加载是模拟主动有氧运动的物理康复疗法。前期工作已经发现机械加载可通过抑制软骨下骨破骨细胞活性治疗小鼠早期OA［8］。但是机械加载对晚期OA的作用尚不清楚。本实验通过建立创伤性OA的小鼠模型，研究机械加载对早、晚期OA 软骨的修复作用，并对早期OA的滑膜炎和晚期OA的骨赘进行研究，比较机械加载对OA早、晚期的治疗效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 8 周龄 SPF 级雌性 C57BL/6 小鼠 36 只，体质量约20 g，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心。实验所用饲料购自北京华阜康生物科技有限公司。实验动物的饲养与管理过程均严格遵守天津医科大学实验动物管理规定。本研究经天津医科大学伦理委员会批准。

1.1.2 主要仪器和试剂 机械加载仪器采用本课题组自主研发并制作的产品（专利号：ZL201621010131.9）。H & E、番红O染料购自美国Sigma公司，石蜡切片机（RM2255）购自德国Leica 公司，光学显微镜BX53购自日本Olympus 公司，SF-400 电子称购自永康市转金工贸有限公司，电子天平购自美国Mrttler Toledo公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及手术造模 36 只小鼠采用随机数字表法分成正常对照（Control）组、OA 手术（OA）组和机械加载治疗（OAL）组，每组又分成2周和8周亚组（n=6）。用1.5%异氟烷麻醉小鼠，于右下肢膝关节内侧打开关节腔，使用手术显微镜和显微外科技术横断内侧副韧带（图1A 箭头所示），摘除内侧半月板（图1A虚线所示）［8］。Control组只切开关节内侧皮肤。术后使用丁丙诺啡盐酸盐镇痛并使用恩氟沙星抗感染3 d。

1.2.2 机械加载治疗 OAL组小鼠经1.5%的异氟烷吸入麻醉后，采用定制的机械加载治疗仪进行治疗。将小鼠膝关节外侧、内侧置于加载杆和定子之间，松紧应适宜，太紧容易影响血液供应（图1B圆圈所示）。在手术后1周，机械加载作用于膝关节（图1C）。加载力为1 N，频率为5 Hz，每天加载5 min，直至小鼠处死。Control组和OA组小鼠仅麻醉后置于加载台上。

1.2.3 H & E和番红O/快绿染色 小鼠在手术后2周和8周处死。剥离小鼠后腿，剔除皮肤、软组织及韧带，保留完整膝关节。组织在10%中性福尔马林中固定72 h 后在14%的EDTA 中脱钙2 周。然后将组织包埋在石蜡中，沿关节矢状面从内向外连续切成5 µm 的截面。组织切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化后，进行H & E 和番红O/快绿染色，脱水透明后树胶封片，显微镜下观察组织病理形态学改变。使用Olympus CCD DP73软件进行相关数据的测量。

1.2.4 软骨的组织学分析 测量透明软骨（hyaline cartilage，HC）厚度、全部软骨（total articular cartilage，TAC）厚度。HC厚度为胫骨软骨表面到潮线的距离，潮线为一条嗜碱性的线，H & E染色呈蓝色。TAC厚度为软骨表面到软骨下骨板的距离。分别在胫骨平台中点、两个边缘处、中点与边缘之间的中点处5个点进行测量，然后取平均值。软骨国际骨关节炎研究学会（OARSI）评分［9］。使用相对数据比较造模后2周和8 周OA 的病理变化以及机械加载的治疗效果，OA组和Control组之间的相对数据为（Control-OA）/Control×100%，OAL组和OA组之间的相对数据为（OAL-OA）/OA×100%［10］。

1.2.5 滑膜的组织学分析 根据滑膜衬里细胞厚度和细胞密度进行评分，评价滑膜的病理变化。1～2层细胞计1分，2～4层细胞计2分，10层及以上计3分。滑膜评分从内侧胫骨、内侧股骨、外侧胫骨和外侧股骨四个象限获得，求出四个象限的平均值（范围0～6 分）［11］。细胞密度分为4 级，正常细胞密度为0 级，轻微增加为1 级，中等增加为2 级，显著增加为3级。

Fig.1 Schematic diagram of induced osteoarthritis and mechanical loading图1 诱导OA和机械加载示意图

1.2.6 骨赘的组织学分析 骨赘评分根据骨赘的大小和成熟度。骨赘的大小分为4级，0=正常，1=轻度增加，2=中度增加，3=显著增加。骨赘的成熟度分为5级，0=正常，1=前软骨损伤，2=显著的软骨化，3=骨和软骨的混合，4=显著骨化［12］。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0 统计软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，2组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间多重比较行LSD-t检验，使用Person 相关分析检测滑膜和骨赘与软骨之间的相关性。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 机械加载改善早期OA的病理变化 H & E和番红O/快绿染色显示，与Control组相比，OA组小鼠内侧胫骨平台表面不连续，软骨层着色变浅，大量基质丢失，软骨细胞数目减少，并有少量软骨细胞出现肥大和凋亡，产生少量的空泡细胞（图2A、B），滑膜衬里细胞层明显增厚（图2C红线所示），细胞密度明显增加（图2C），HC 厚度明显变薄，TAC 厚度下降，OARSI 和滑膜评分增加（均P＜0.05）。经机械加载治疗后，OAL组小鼠胫骨平台软骨表面连续，抑制了基质的丢失，软骨层着色得到改善，软骨细胞肥大和凋亡明显减少，透明软骨厚度和全部关节软骨厚度明显增加，OARSI 评分和滑膜评分显著下降（均P＜0.05），见表1。

Tab.1 Comparison of HC，TAC,OARSI score and synovial score in early osteoarthritis between three groups of mice表1 早期OA HC厚度、TAC厚度、OARSI评分和滑膜评分的比较 （n=6，±s）

Tab.1 Comparison of HC，TAC,OARSI score and synovial score in early osteoarthritis between three groups of mice表1 早期OA HC厚度、TAC厚度、OARSI评分和滑膜评分的比较 （n=6，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a与Control组比较，b与OA组比较，P＜0.05

组别Control组OA组OAL组F HC厚度（µm）55.74±5.22 43.73±7.12a 51.65±6.98ab 5.296＊TAC厚度（µm）100.87±4.96 91.19±5.65a 99.20±0.99ab 8.358＊＊OARSI评分（分）1.17±0.41 6.17±1.94a 2.00±0.89ab 27.289＊＊滑膜评分（分）1.00±0.63 5.00±1.26a 2.17±1.17ab 22.624＊＊

2.2 机械加载改善晚期OA的病理变化 H & E和番红O/快绿染色显示，与Control组相比，造模后8 周OA组小鼠内侧胫骨平台出现严重的软骨缺失，大面积的软骨着色丢失，软骨细胞数目显著减少，以及更多的空泡细胞（图3A、B），HC 厚度和TAC 骨厚度显著下降，OARSI评分显著升高（P＜0.01），见表2。同时小鼠膝关节可见骨赘形成（图3C红线所示），骨赘形成评分增加（P＜0.01）。经机械加载治疗后，OAL组小鼠HC 厚度（图3A），TAC 厚度均得到了恢复，OARSI 评分下降，骨赘形成评分下降（均P＜0.05），见表2。

2.3 滑膜炎症和骨赘形成与软骨退化之间的相关性分析 相关性分析表明，早期OA阶段滑膜评分与OARSI评分之间呈正相关（r=0.659，P＜0.05）。在晚期OA 中，骨赘形成评分与OARSI 评分之间呈正相关（r=0.711，P＜0.05）。

2.4 OA 早、晚期病变程度及机械加载治疗效果的比较 相对数据表明，术后8周OA组与Control组之间HC相对厚度、TAC相对厚度较术后2周明显增加（均P＜0.01），OARSI 相对评分与术后2 周差异无统计学意义，见表3。术后8周OAL组与OA组之间HC相对厚度、TAC 相对厚度较术后2 周明显增加（均P＜0.01），OARSI相对评分与术后2周差异无统计学意义，见表4。

3 讨论

3.1 OA 的研究现状 OA 是最常见的慢性关节疾病之一，其发病率逐年升高。OA是因全身或局部因素造成的关节不稳导致软骨退化、滑膜炎症、骨赘形成等病理变化的关节疾病，已逐渐成为一个重要的社会问题［13］。软骨在关节活动中起着重要的作用，关节不稳极易导致软骨的损伤，从而影响关节运动。本实验以创伤性骨关节炎小鼠为模型，从软骨改善、抑制滑膜炎症和骨赘形成等角度，探讨机械加载对早、晚期OA小鼠病理变化的改善作用。

3.2 运动康复对OA的改善作用 运动康复训练是OA的重要治疗手段［14］。缺乏运动会导致肌肉乏力、萎缩以及骨质疏松，均会增加患OA 的概率，关节的运动可以使滑液和软骨下骨的营养扩散到软骨，并处理软骨代谢所产生的废物，适度运动不仅可以预防OA的发生发展，还能明显减轻疼痛、控制体质量。机械加载作为一种代替人体主动运动的新型物理康复治疗方式，以生理性频率对关节进行机械刺激从而产生治疗效果。相比传统的运动康复训练，机械加载能够更好地帮助不能从事体力活动的患者进行主动物理运动，起到康复的作用。

Tab.2 Comparison of HC，TAC,OARSI score and osteophyte score in lated osteoarthritis between three groups of mice表2 晚期OA HC厚度、TAC厚度、OARSI评分和骨赘评分的比较 （n=6，±s）

Tab.2 Comparison of HC，TAC,OARSI score and osteophyte score in lated osteoarthritis between three groups of mice表2 晚期OA HC厚度、TAC厚度、OARSI评分和骨赘评分的比较 （n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a与Control组比较，b与OA组比较，P＜0.05

组别Control组OA组OAL组F HC厚度（µm）44.95±4.57 9.51±6.83a 41.49±8.52ab 49.045＊＊TAC厚度（µm）98.29±7.60 15.61±4.64a 89.59±10.32ab 200.122＊＊OARSI评分（分）2.50±1.05 16.83±4.71a 4.68±1.51ab 42.082＊＊骨赘大小评分（分）0 3.83±0.41a 1.67±0.82ab 79.800＊＊骨赘成熟度评分（分）0 4.17±0.75a 2.00±0.89ab 57.195＊＊

Tab.3 Comparison of pathological changes between early osteoarthritis and late osteoarthritis表3 早、晚期OA病理变化的比较 （n=6，%，±s）

Tab.3 Comparison of pathological changes between early osteoarthritis and late osteoarthritis表3 早、晚期OA病理变化的比较 （n=6，%，±s）

＊＊P＜0.01

组别2周组8周组t HC相对厚度21.28±12.71 78.57±15.65 6.960＊＊TAC相对厚度9.49±5.68 84.14±4.72 24.768＊＊OARSI相对评分475.00±244.43 731.94±508.05 1.116

Tab.4 Comparison of therapeutic effect of mechanical loading between early osteoarthritis and late osteoarthritis表4 机械加载对早、晚期OA治疗效果的比较（n=6，%，±s）

Tab.4 Comparison of therapeutic effect of mechanical loading between early osteoarthritis and late osteoarthritis表4 机械加载对早、晚期OA治疗效果的比较（n=6，%，±s）

＊＊P＜0.01

组别2周组8周组t HC相对厚度20.99±26.63 518.69±369.57 3.290＊＊TAC相对厚度8.85±6.11 536.44±275.37 4.692＊＊OARSI相对评分66.44±15.77 69.71±13.81 0.383

3.3 机械加载对软骨的保护作用 研究证明，机械加载通过Rac1介导的p38MAPK 信号通路减轻软骨中基质金属蛋白酶（MMP）-13 的激活，从而对软骨产生保护作用［15］。在早期创伤性OA 动物模型中，机械加载治疗可以通过抑制破骨细胞系改善骨重塑，抑制创伤部位的炎性反应，保护骨关节炎的软骨［8］。在本研究中，通过建立创伤性OA 模型，观察OA 手术后2 周和8 周的病理变化。结果显示，机械加载可以增加OA 小鼠透明软骨和全部关节软骨的厚度，降低OARSI 评分。这些发现均证实了机械加载对软骨的治疗作用。

3.4 机械加载对滑膜炎和骨赘形成的抑制作用 滑膜炎发生在关节损伤之后，并且软骨的退化和滑膜炎之间有着显著的联系［6，17］。骨赘形成是OA晚期的一个特征性病变［18］。本研究发现，机械加载能够降低滑膜评分和骨赘形成评分，表明机械加载对滑膜炎和骨赘形成的治疗作用。此外，相关性分析表明，早期OA 滑膜炎与软骨退化之间呈正相关，晚期OA骨赘形成和软骨退化之间也呈正相关，这说明机械加载在早期OA时通过抑制滑膜炎症，而在晚期OA时通过抑制骨赘形成来治疗OA。

3.5 机械加载对晚期骨关节炎的治疗效果更好 本研究使用相对数据来评估早、晚期OA 病变的不同以及机械加载的治疗效果。研究发现，随着时间的延长，晚期OA的病变相比早期OA明显更严重，而机械加载对晚期OA的治疗效果也更明显。

3.6 机械加载减轻OA病理进展 机械加载通过提高HC、TAC厚度，降低OARSI评分，对早、晚期OA的软骨产生保护作用。并且，这种保护作用在OA早期与抑制滑膜炎症相关，在OA晚期与抑制骨赘形成相关，笔者总结见图4。

Fig.4 Mechanical loading reduces the pathological progress of osteoarthritis图4 机械加载减轻OA病理进展

3.7 不足与展望 临床中治疗OA 的药物作用有限，不良反应较大，效果不确切。因此，找到一种有效的治疗手段是目前这一领域所面临的重大挑战。本实验表明，膝关节机械加载可通过保护软骨、抑制滑膜炎症和骨赘形成来对早、晚期OA产生显著的治疗效果。然而，其对OA的具体作用机制还需进一步研究与探讨。

Fig.2 Histological staining of medial tibial cartilage and synovium at 2 weeks图2 2周内侧胫骨软骨以及滑膜的组织学染色

Fig.3 Histological staining of medial tibial cartilage and osteophyte at 8 weeks图3 8周内侧胫骨软骨以及滑膜的组织学染色