融合蛋白G3G6和HST1致敏DC疫苗抗黑色素瘤的药效学研究

王 睿，王永梅，蔡铭君，柯学佳，吴 越，崇 军，曹荣月**

(1中国药科大学生命科学与技术学院，南京 211198；2上海复星长征医学科学有限公司，上海 200444)

恶性黑色素瘤(malignant melanoma，MM)是一种起源于神经嵴黑色素细胞并由异常黑色素细胞过度增生引发的高度恶性肿瘤[1]，主要见于皮肤，发病率约占所有恶性肿瘤的1%～3%。因MM对放疗及化疗的敏感性差，临床治疗难度大，有效率低，寻求各种治疗方法以延长MM患者的生存期是治疗的关键[2]。近年来，随着生物技术的迅速发展，以调动机体的免疫功能来抑制肿瘤细胞增殖为基础的肿瘤免疫治疗，已被广泛研究和应用于临床并取得了一定疗效，成为继手术、放疗和化疗之后的又一重要的治疗手段[3]。

树突状细胞(dendritic cell，DC)是目前发现功能最强，能激活初始T细胞的专职抗原递呈细胞，可以诱导、调节和维持CD4+和CD8+T细胞免疫反应[4-6]。以DC为基础的免疫疗法已被应用于恶性肿瘤(如黑色素瘤)的治疗[7]。然而，DC的主要功能不是消除病原体，而是在其表面上呈递其抗原，从而诱导T细胞对病原体的特异性免疫应答[8]。因此，选取合适肿瘤抗原刺激DC，是DC疫苗发挥治疗作用的关键。

促性腺激素释放激素(gonadotropin releasing hormone，GnRH)及其受体在多种肿瘤细胞表面高表达，作为重要介质和其他生物因子一起构成复杂的信号转导网络，可通过对性腺轴内分泌调节、对细胞的自分泌调节发挥肿瘤抑制作用[9]。而胃泌素释放肽(gastrin releasing peptide，GRP)是一种含有27个氨基酸的胃肠道神经激素。研究证实GRP与许多恶性肿瘤的发生、转移和侵袭密切相关，并可以刺激肿瘤的生长，通过自分泌或旁分泌途径参与肿瘤新生血管形成并促进肿瘤转移[10]。

在许多肿瘤患者体内，多因肿瘤抗原无法识别或T细胞无法活化而发生免疫逃逸[11]。为避免该现象，选用GnRH与GRP偶联的融合蛋白制得双靶点DC疫苗来探究其对黑色素瘤的抑制效果。

相比正常组织，六跨膜前列腺上皮抗原(six transmembrane epithelial antigens of prostate 1，STEAP1)在多种肿瘤类型中过度表达，包括黑色素瘤、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌、卵巢癌和尤文肉瘤[12-17]，可认为STEAP1是一个理想的抗肿瘤疫苗靶点。而研究表明，当STEAP1应用为单靶点DNA疫苗进入体内时，其免疫原性较差[18]。近年来，已开发出各种免疫佐剂以避免强不良反应，载体蛋白如分枝杆菌热休克蛋65(HSP65)具有这种佐剂特性。研究表明，HSP65抗原不仅可以上调细胞免疫反应[19]，还可以显着提高负荷抗原的免疫原性，刺激机体产生免疫反应[20-21]。因此，本研究选用STEAP1为另一致敏DC抗原，并将其与HSP65偶联以增强免疫原性。

1 材 料

1.1 菌种和质粒

菌种EscherichiacoliBL21(DE3),pET28a-GnRH3-hinge-MVP-GRP6,pET-28a-His-HSP65-STEAP1186-193质粒均为本实验室保存。

1.2 动物和细胞株

C57BL/6J雄性小鼠(6周龄，扬州大学实验动物中心，SCXK(苏)2017-0007)；黑色素瘤B16F10细胞株为本实验室保存。所有动物实验均符合动物伦理委员会标准。

2 方 法

2.1 融合蛋白的制备

对实验室现存含有目的基因的工程菌pET28a-GnRH3-hinge-MVP-GRP6和pET-28a-His-HSP65-STEAP1186-193进行诱导表达，将表达蛋白分离提取并纯化，真空冷冻干燥后得到融合蛋白GnRH3-GRP6(G3G6)和HSP65-STEAP1(HST1)冻干粉末。

2.2 B16F10黑色素瘤细胞的培养

从液氮中取出冻存的B16F10黑色素瘤细胞，37 ℃ 水浴解冻后加入RPMI 1640培养基10 mL混匀，离心弃上清液，加入全培养基重悬，37 ℃、5%CO2下培养48 h，观察细胞生长状态，换液传代培养。

2.3 DC疫苗的制备

脱颈处死小鼠，75%乙醇消毒5 min，无菌取出小鼠后腿的胫骨和股骨，剪断两端骨骺，用不完全培养基冲洗骨腔直至骨变白，将冲洗液离心弃上清液，重复洗涤沉淀1次，加入红细胞裂解液10 mL混匀静置(室温、3 min)，离心除去红细胞，重悬洗涤调整细胞数为每毫升5×106个，加入含有20 ng/mL rmGM-CSF，10 ng/mL rmIL-4的完全培养基，隔日半量换液，在第7天分组加入20 μg/mL已纯化的G3G6以及HST1融合蛋白以致敏DC，继续培养24 h，观察细胞的数量形态，离心后调整细胞数为每毫升1×106个，即得DC疫苗。

分组策略如下：(1)G3G6融合蛋白致敏DC(G3G6-DC)组；(2)HST1融合蛋白致敏DC(HST1-DC)组；(3)G3G6及HST1联合致敏DC(GH-DC)组；(4)未致敏DC(US-DC)组，加入与融合蛋白等量完全培养基，作为阴性对照组。

2.4 流式细胞仪检测DC成熟度

收集未致敏DC和融合蛋白致敏的DC到检测管中，离心后用PBS进行洗涤，再次离心后用预冷的PBS 100 μL重悬，采用FITC抗小鼠CD11c，PE抗小鼠CD86和APC抗小鼠CD80标记所有细胞样品并设置对照组，冰浴避光染色30 min，离心用预冷的PBS 200 μL重悬，以未致敏DC组作为阴性对照进行流式检测。

2.5 体内药效为研究

2.5.1 B16F10黑色素瘤细胞的培养和皮下移植模型的建立 调整B16F10黑色素瘤细胞单细胞悬液密度为每毫升5×106个，与第0天接种于小鼠腋部皮下。

2.5.2 荷瘤小鼠的分组及免疫方法 将动物随机分为4组，每组5只，按照未致敏DC(US-DC)组，G3G6融合蛋白致敏DC(G3G6-DC)组，HST1融合蛋白致敏DC(HST1-DC)组和G3G6及HST1联合致敏DC(GH-DC)组于第3、10、17天进行免疫治疗，于第8、12、16、20天对小鼠进行称重，第21天处死小鼠取各组肿瘤、脾脏、胸腺称重，计算抑瘤率(IR)和脏器指数，留脾脏培养用于效靶比测定实验。给药方式见表1。

IR=(对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100%

(1)

脏器指数=脏器质量(mg)/体重(g)×100%

(2)

Table1 Dosing regimen of C57BL/6J (n=5)

GroupDosage (Per mouse)AdministrationUS-DC5×105 cellsiHG3G6-dc5×105 cellsiHHST1-DC5×105 cellsiHGH-DC5×105 cellsiH

US-DC:unsensitized DC;G3G6-DC:G3G6 fussion protein sensitized DC;HST1-DC:HST1 fusion protein sensitized DC;GH-DC:G3G6 and HST1 fusion protein sensitized DC

2.5.3 黑色素瘤块病理分析 将剥取的肿瘤组织浸没于10%福尔马林溶液中固定24 h，送交第三方切片公司，HE染色检验。

2.6 脾细胞的培养

剥取的小鼠脾脏称重后研磨过筛网(100目)，PBS洗涤重悬，加入等量的红细胞裂解液，离心取沉淀，经PBS洗涤后离心取沉淀，调整细胞数为每毫升1×107个，加入完全培养基5 mL，37 ℃，5%CO2下按原分组进行培养，观察细胞生长状态同时给细胞换液传代。

2.7 最佳效靶比的确定

调整培养脾脏细胞数为每毫升2×106个，按每孔100 μL接种于96孔板中。以DC疫苗与细胞悬液分别作为效应细胞和靶细胞，按1∶5，1∶10以及1∶15的比例加入靶细胞。效应细胞分组∶未致敏DC组，G3G6融合蛋白致敏DC组，HST1融合蛋白致敏DC组和联合致敏DC组。培养48 h后按CCK-8检测试剂盒测定吸收度并计算增殖指数(SI)。

2.8 统计分析

实验中采用 SPSS 19.0统计软件分析，采用方差检验分析组间差异，P<0.05表示差异有统计学意义。整体实验流程如图1所示。

Figure1 Experimental flow chart

3 结 果

3.1 DC细胞的培养与成熟分化

如图2所示，在培养初期，DC细胞均呈圆形且直径较小(图2-A)。随培养时间的延长，DC细胞直径逐渐增大并且有堆叠生长的趋势(图2-B)。培养第6天可观察到部分DC细胞表面伸出伪足，融合蛋白致敏后则大部分DC细胞表现出树突状(图2-D)，即成熟树突状细胞的特征。

Figure2 Morphology of dendritic cells (DC) under microscope (200×)
A-D:DC training photos of the second day,the fourth day,the sixth day and the eighth day,respectively

经流式细胞仪检测，结果用BD Accuri C6进行分析，如图3，所有细胞都处于CD11c阳性范围中。相同培养时间，未经蛋白致敏的DC细胞中表达成熟信号分子的细胞占比3.2%，经G3G6融合蛋白致敏成熟的细胞占比8.9%，经HST1融合蛋白致敏的成熟细胞表达标志分子的强度则为7.6%，而经G3G6和HST1两融合蛋白联合致敏的DC细胞成熟率高达15.6%。由此说明，DC细胞在G3G6和HST1两融合蛋白联合刺激后能够显著上调CD11c，CD86和CD80的表达量(P<0.05)，而融合蛋白G3G6与HST1的致敏效果引起的表达上调之间并无显著差异(P>0.05)。

3.2 DC疫苗的体内药效探究

为探究融合蛋白致敏DC疫苗的抗肿瘤效果，本研究选择在C57BL/6J雄性小鼠体内构建黑色素瘤模型进行探究。在第0天将培养适当的B16F10黑色素瘤细胞悬液接种于小鼠腋下，并在第3、10、17天分组向小鼠体内注射融合蛋白致敏DC疫苗进行治疗。在第8、12、16、20天分别测定并计算各组小鼠负荷肿瘤面积和面积并绘制生长曲线如图4。由生长曲线，各融合蛋白致敏DC组的肿瘤面积和肿瘤体积均小于注射未致敏DC组，可认为各实验组均有抑瘤效果，其中联合致敏组即GH-DC组抑瘤效果最佳。

US-DC:Unsensitized DC;G3G6-DC:GnRH-GRP fusion protein senditized DC；HST1-DC:HSP65-STEAP1 fusion protein sensitized DC;GH-DC:G3G6 and HST1 combined sensitized DC

肿瘤面积计算公式：

A=L×W

(3)

其中:A为肿瘤面积，L为长度，W为宽度。

肿瘤体积计算公式：

V=L×W2/2

(4)

其中:V为肿瘤体积，L为长度，W为宽度。

于第24天结束治疗，处死小鼠并分组剥去肿瘤组织、脾脏和胸腺称重并拍照如图5。由肿瘤组织照片，可观察出各融合蛋白致敏DC组瘤块均小于未致敏DC组。数据处理得：G3G6-DC组的抑瘤率为35.75%，HST1-DC组的抑瘤率为34.03%，而GH-DC的抑瘤率为55.74%，差异有统计学意义(P<0.01)。

由公式(2)得脾脏脏器指数和胸腺脏器指数。如图6，相比未致敏组，各融合蛋白致敏DC组小鼠的脾脏和胸腺均有增大，其中联合致敏组的增大最为显著，具有统计学意义(P<0.01)。由此可证明，融合蛋白致敏DC可有效激发小鼠体内免疫系统，从而发挥抗肿瘤效果。

3.3 肿瘤组织切片分析

为进一步研究融合蛋白致敏DC疫苗抑制肿瘤的药效，光学显微镜观察组织染色切片。如图7显示，US-DC组中少见肿瘤组织坏死，核固缩、核碎裂或溶解；可见病理性核分裂象，如黄色箭头所示；多见肿瘤细胞肿胀，胞质疏松或呈空泡化，如红色箭头所示；少量肿瘤细胞凋亡，如蓝色箭头所示；无明显炎症细胞浸润。G3G6-DC组可见较大面积组织细胞坏死，核固缩、核碎裂或溶解，并伴有大量出血，如黑色箭头所示；部分肿瘤细胞凋亡，如蓝色箭头所示。HST1-DC组中肿瘤组织局部出血，细胞红染，无细胞结构，如黑色箭头所示；多见肿瘤细胞肿胀，胞质疏松或呈空泡化，如红色箭头所示；局部出现小型钙化灶，如绿色箭头所示；少量肿瘤细胞凋亡，如蓝色箭头所示。GH-DC组肿瘤组织较松散，一处被膜处大面积出血，局部少量出血；少量肿瘤组织坏死，核固缩、核碎裂或溶解如黑色箭头所示；部分肿瘤细胞肿胀，胞质疏松或呈空泡化，如红色箭头所示；少量肿瘤细胞凋亡，如蓝色箭头所示。由此可见，相比未致敏组，各融合蛋白致敏DC组均可诱导机体杀伤肿瘤细胞，其中GH-DC组即联合致敏组效果优于单一致敏组。

Figure7 Histopathology change of tumor tissues

3.4 最佳效靶比的确定

如图8，CCK-8检测结果表明各实验组均可刺激T细胞的增殖，其中效靶比为1∶5和1∶10的增殖指数均高于1∶15，可认为较高浓度的DC可以对刺激T淋巴细胞增殖产生更显著的效果；与未致敏DC组相比，G3G6-HST1联合致敏DC组可以形成较高的增殖效应(P<0.01)，其增殖指数高于G3G6融合蛋白致敏DC组与HST1融合蛋白致敏DC组(P<0.05)。

4 讨 论

免疫治疗在提高肿瘤治疗率、改善患者生活质量、延长生存期方面起重要作用[8]。DC疫苗可以通过负荷肿瘤抗原回输体内对肿瘤进行靶向治疗[22]。本研究以黑色素瘤的免疫治疗为主题，先后研究了单、双靶点的蛋白疫苗和DC疫苗[23-29]，顺延实验室研究思路，选取偶联双抗原的融合蛋白、偶联免疫佐剂的抗原融合蛋白致敏DC疫苗，探究提高抗肿瘤药效的途径。

DC是目前认为功能最强的专职APC，未成熟DC接触抗原后可通过巨胞饮、受体介导的内吞及吞噬3种方式捕获抗原，幼稚DC在摄取抗原后即可自发成熟[30]，而DC成熟之后倾向于诱导免疫应答[31]，利用DC疫苗进行治疗的第一步应考虑提高DC的成熟率。

实验结果显示，相比阴性对照组，G3G6融合蛋白和HST1融合蛋白均具有足以提高DC的成熟率强度的免疫原性，大大增加了DC诱导免疫应答的潜力。其中两种融合蛋白的免疫原性之间并无显著差异(P>0.05)，联用组效果显著增强(P<0.01，vsUS-DC)则可归因于免疫原性的叠加性。另有体内实验证实，G3G6和HST1致敏DC疫苗均可有效激活免疫系统杀伤肿瘤细胞，且融合蛋白致敏DC抗肿瘤疫苗具备靶向性可达到精准治疗，推测原因为G3G6-DC疫苗的双抗原选择有效避免了肿瘤的免疫逃逸；而HST1-DC疫苗则因免疫佐剂的偶联，同样提高了免疫系统对肿瘤细胞的杀伤作用。后续将就融合蛋白致敏DC疫苗的作用机制展开实验，确定免疫途径进一步完善治疗策略。

为防止过度免疫而导致自身免疫紊乱等问题的发生，本研究继续探究了DC疫苗治疗的最适效靶比，结果得当效应细胞(即DC)与靶细胞(即脾细胞)的比例为1∶5时，细胞增殖效果最佳(P<0.01，vsUS-DC)。目前有报道，靶细胞对于DC的依赖并非线性关系[22,32]，可考虑进一步细化探究效靶比，寻找DC疫苗的最低有效剂量，为后期临床使用创造便利。

综上所述，融合蛋白致敏DC疫苗G3G6-DC和HST1-DC均可增强树突状细胞的免疫应答，提高对黑色素瘤B16F10细胞小鼠移植瘤生长的抑制，且联合用药效果优于单独用药，实验结果有统计学意义。