芝麻素联合顺铂抗肺癌细胞H460的作用机制研究

刘冰，陈岳铭，李华超

(广东药科大学药学院，广东 广州 510006)

肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一且其发病率呈不断上升的趋势，其中，非小细胞肺癌占据了85%的肺癌病例[1-2]。化疗仍是肺癌主要的治疗方法，然而目前对肺癌的化疗存在有效率不高，副作用较大的缺陷，故从天然植物中提取有效成分作为辅助用药来提高化疗疗效并减少不良反应也成为了一种新的抗癌方案[3]。Akt是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，研究表明，Akt在癌组织的表达显著高于癌旁组织[4]，Akt的过表达与肺癌的发生进展密切相关[5]。因此Akt也许是治疗肺癌的一个新的靶点。芝麻素是芝麻籽油中含量最丰富的木脂素，研究表明芝麻素具有抗高血压、抗血栓形成及抗高胆固醇血症的特性[6]。另外，在受试者中证实了芝麻素是安全且可耐受的[7]。已有研究显示芝麻素的抗肿瘤作用[8]，但有关芝麻素与顺铂联用对肺癌的抑制作用仍未见报道。本研究以人肺癌细胞H460为研究对象，观察芝麻素与顺铂联合给药对H460细胞增殖的抑制作用。

1 材料与仪器

1.1 材料

人肺癌细胞H460细胞株购自ATCC

1.2 主要试剂与仪器

芝麻素、顺铂(Selleckchem)；RPMI-1640培养基、胎牛血清(美国GIBCO公司)；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；恒温培养箱(美国Thermo公司)；Mulitiskan GO全波长酶标仪(美国Thermo公司)；抗体p-Akt(ser473)、β-tubulin(美国CST公司)；PVDF膜(美国Millipore公司)；其余试剂均为国产分析纯。

2 方法

2.1 细胞培养

H460使用RPMI-1640培养基培养，所用培养基中均含有10%(φ)胎牛血清(FBS)，在37 ℃含有5%(φ))CO2的培养箱中培养。实验用的芝麻素溶于DMSO备用，顺铂溶于DMF备用。

2.2 增殖抑制实验

取对数生长期的细胞株H460细胞，经蛋白胰酶消化，以每孔4×103个细胞接种于96孔板中，每孔100 μL。培养过夜，弃去原培养基，实验组加入RPMI-1640培养基200 μL稀释的不同浓度(5、10、15、20、25、30、40 μmol/L)的芝麻素、顺铂或两者联用，对照组加入RPMI-1640培养基200 μL稀释的DMSO，空白对照组不加细胞仅加RPMI-1640培养基200 μL。继续培养24 h或48 h后，吸干培养基，每孔100 μL RPMI-1640培养基加入20 μL MTT，置37 ℃，5%(φ)CO2培养箱中避光孵育4 h后，吸干培养基，每孔加入150 μL DMSO，摇床摇10 min后在酶标仪563 nm波长下测定各孔吸光度值(A)。抑制率=1-(实验组A值-空白对照组A值)/(溶剂对照组A值-空白对照组A值)×100%。

2.3 免疫印迹实验

检测H460细胞中p-Akt蛋白的表达。将细胞接种于6孔板中，加入不同浓度(10、20、30 μmol/L)芝麻素处理12 h后，在每孔细胞中加入100 μL的蛋白裂解液后，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度，计算每个泳道的上样量为70 μg总蛋白，计算5× loading buffer量及超纯水量，定量，变性。蛋白在10%SDS/PAGE分离并转移至PVDF膜上。使用TBST洗膜3次后，用含5%脱脂牛奶的TBST室温封闭1 h，TBST洗膜3次，加入稀释好的一抗p-Akt(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜。用TBST洗膜3次后，加入稀释好的羊抗兔二抗(1∶1 000)，室温孵育1 h后，用TBST洗膜3次，然后加入ECL化学发光液，暗房曝光、显影、定影。

2.4 协同指数(CI)

芝麻素与顺铂之间的相互作用由协同指数(CI)来确定，根据公式：CI=(D)1/(Dx)1+(D)2/(Dx)2，(Dx)1、(Dx)2分别表示给定的抑制率所需的芝麻素剂量和顺铂的单独剂量。(D)1 和(D)2是芝麻素或顺铂产生相同效果所必需的剂量。芝麻素与顺铂的联合作用表示如下：CI<1，协同作用，CI=1，加和效应，CI>1，拮抗作用。剂量降低指数DRI由协同指数中剂量降低的水平来确定，(DRI)1=(Dx)1/ (D)1；(DRI)2=(Dx)2/(D)2。

2.5 统计学处理

3 结果

3.1 芝麻素对H460细胞增殖的抑制作用

当芝麻素的给药浓度为5、10、15、20、25、30、40 μmol/L 7个浓度时，MTT实验结果可以看出，芝麻素在48 h对H460细胞增殖的抑制率均强于24 h。当浓度≥10 μmol/L时，芝麻素对H460细胞抑制率与对照组比较差异有统计学意义。提示在一定的浓度范围内，芝麻素对H460细胞增殖的抑制率随着药物浓度的升高而升高，且有剂量依赖性(图1)。

3.2 芝麻素对H460细胞p-Akt表达的影响

当芝麻素的给药浓度为10、20、30 μmol/L，孵育12 h后，从Western blot结果可以看出，芝麻素可抑制H460细胞p-Akt的表达，且呈剂量依赖性(图2)。

与24 h对照组比较：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001； 与48 h对照组比较：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。

图1不同浓度芝麻素对H460细胞增殖的影响

Figure1Effect of sesamin at different concentrations on the proliferation of H460 cells

图2不同浓度的芝麻素对p-Akt表达的影响

Figure2Effect of sesamin at different concentrations onp-Akt expression

3.3 顺铂联合芝麻素对H460细胞增殖的影响

从给药48 h后的MTT结果可以看出，当顺铂(3 μmol/L)联合芝麻素(15 μmol/L)给药时，联合给药组对H460细胞增殖抑制效果要强于顺铂(6 μmol/L)或芝麻素(30 μmol/L)给药组。说明顺铂(3 μmol/L)联合芝麻素(15 μmol/L)给药存在协同效应(图3)。

3.4 顺铂联合芝麻素对H460细胞增殖抑制的协同效应

从Fa-CI plot图可以看出，顺铂(0.75 μmol/L)与芝麻素(4 μmol/L)联合使用时，CI值>1，提示两者在此浓度下不存在协同效应。另外，顺铂(1.5 μmol/L)联合芝麻素(8 μmol/L)、顺铂(3 μmol/L)联合芝麻素(16 μmol/L)、顺铂(6 μmol/L)联合芝麻素(32 μmol/L)、顺铂(12 μmol/L)联合芝麻素(64 μmol/L)4个给药组的CI均<1，提示在顺铂(1.5～12 μmol/L)联合芝麻素(8～64 μmol/L)此范围内，对H460细胞增殖抑制效果存在协同效应(图4)。

与不加药对照组比较：**P<0.01； 与顺铂(6 μmol/L)比较：#P<0.05; 与芝麻素(30 μmol/L)比较:+P<0.05。

图3单用芝麻素/顺铂或芝麻素联合顺铂对H460细胞增殖的影响

Figure3Effect of sesamin,cisplatin or combination of both on the viability of H460 cells

图4顺铂联合芝麻素对H460细胞增殖抑制的协同效应

Figure4Synergistic effect of cisplatin and sesamin on anti-proliferation of H460 cells

3.5 顺铂联合芝麻素对p-Akt表达的影响

从Western blot结果可以看出，单独使用顺铂时(3 μmol/L)时，对p-Akt的表达无显著影响。当顺铂(3 μmol/L)联合芝麻素(20 μmol/L)时，可显著降低p-Akt的表达(图5)。

图5顺铂联合芝麻素对p-Akt表达的影响

Figure5Effect of cisplatin combined with sesamin onp-Akt expression

4 讨论

目前，肺癌治疗新技术不断呈现，尤其是细胞分子生物学及化疗药理学的迅猛发展，使得寻找活性强、选择性强、低毒的抗癌方法成为肺癌治疗的发展方向[9]。中药单体具有取材方便、价格低廉的优点；西药具有靶向作用强、见效快的特点[10]。而将中药单体和西药联合使用抗癌，将两者有效联合在一起，可使其最大限度地发挥作用。芝麻素是从芝麻籽油中提取出来的一种木脂素，它对乳腺癌及肺癌均有显著的抑制作用[8,11]。顺铂是临床常用的肺癌化疗药，可抑制肿瘤细胞DNA复制过程，因其抗癌谱广，作用强而广泛应用，但容易产生耐药性[12]。从本研究结果可以看出，顺铂与芝麻素联合使用对肺癌细胞H460的增殖抑制效果明显，且两者联合使用可产生协同作用。

PI3K/Akt信号通路作为癌细胞内重要信号转导通路之一，参与许多重要的生物学过程的调控，活化的Akt可影响下游多个效应分子，发挥促进增殖、抑制凋亡的作用，与多种肿瘤的发生与进展密切相关[13]。研究表明，在43%～90%的非小细胞肺癌病例中，均可观察到癌组织中的p-Akt的表达水平显著高于癌周组织[14]。此外，临床研究表明[15]，激活的Akt通路与肺癌的侵袭性与预后不良密切相关。本研究结果表明，芝麻素可显著地抑制p-Akt的表达。单用顺铂(3 μmol/L)对p-Akt表达无影响，而当顺铂联合芝麻素使用时，可显著地抑制p-Akt的表达(与芝麻素和顺铂产生的协同作用类似)。芝麻素抑制Akt活性的机制还需要进一步实验研究。

本实验中，顺铂联合芝麻素给药可产生协同效应，同时，两者联用时可协同抑制p-Akt的表达，提示顺铂联合芝麻素所产生的协同效应可能是通过抑制p-Akt的表达来实现的。由于芝麻素的毒性低且与顺铂联合可产生协同作用，芝麻素可能成为顺铂化疗的辅助用药。