一种检测奶样中布鲁氏菌抗体免疫层析方法的建立

肖 妍，李蓉蓉，霍 蕾，董志珍，张俊哲，赵 丹，杨若松，郭 鹏

（1. 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，天津 300461；2. 北京维德维康生物技术有限公司，北京 100095）

布鲁氏菌病（以下简称布病）是由革兰氏阴性的布鲁氏菌属细菌侵入机体后引起的变态反应性疾病，属于人兽共患传染病[1]。布鲁氏菌属主要分为羊种、牛种、猪种、绵羊附睾种、犬种、沙林鼠种及海洋种布鲁氏菌[2]。动物及人类对布鲁氏菌普遍易感，母畜感染后的临床症状主要是流产及不孕，而人类感染后则可表现为发热、多汗、乏力、骨关节和肌肉疼痛、头痛、流产、睾丸炎等非特异性多系统损伤[3]。布病在临床容易被误诊为其他疾病，若治疗不及时、不彻底，易转化为慢性。目前尚无有效的治疗慢性布病方法[4]。据统计，2014年我国新发布病病例数量较2013年增加了30.4%，发病率是1993年的154倍[5]，全国所有省份均有流行或散发病例的报告。

布病的病原学诊断主要是从疑似患者的血液或者组织中分离培养布鲁氏菌来确诊。细菌分离培养技术是最传统的布病细菌学诊断方法，也是诊断布病的“金标准”[6]。然而布鲁氏菌生长十分缓慢，营养要求复杂，培养环境要求高，且阳性检出率低，所以布病的实验室诊断多采用免疫学方法。比较常用的检测方法有虎红平板凝集试验、试管凝集试验、补体结合试验、全乳环试验、酶联免疫吸附试验以及免疫胶体金层析法[7]，如左玉柱等[8]建立的牛布鲁氏菌间接ELISA抗体检测方法，王志明等[9]通过筛选抗布鲁氏菌单克隆抗体建立的检测血清中布鲁氏菌抗体的竞争ELISA方法。这些技术的建立与应用为布病防控提供了较为可靠的技术支持，同时也弥补了以往诊断方法的不足。

免疫层析技术是20世纪80年代初崛起的一种新型免疫学分析技术[10]。其主要原理是通过硝酸纤维素膜的渗透作用，当待检的液体样本流经检测区域时，被检测物可与捕获抗体发生特异性结合而发出标记性信号[11]。张付贤等[12]建立了可成功鉴别牛种布鲁氏菌感染和疫苗免疫的小鼠血清胶体金试纸条，准确性同于ELISA方法。邵丰尧等[13]评价了用于布病现场检测的胶体金产品，对人群和牛群的检测结果敏感性与虎红平板凝集检测结果无明显差异。免疫层析技术因具备价格低廉、操作简单、不需要特殊的仪器设备和专业研究人员等优点而备受青睐[14]。现在市场上的免疫层析产品普遍是通过检测动物血样中的布鲁氏菌抗体诊断布病[15-18]。本研究建立的检测奶样中布鲁氏菌抗体的免疫层析试纸条更加简便，可快速完成检测，适用于奶牛场布病的初筛。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 羊种布鲁氏菌WS-01强毒株：石河子大学鉴定、保存。

1.1.2 试验用奶样 布鲁氏菌阴阳性牛奶样、口蹄疫O型阳性牛奶样、口蹄疫A型阳性牛奶样、口蹄疫亚洲Ⅰ型阳性牛奶样、牛副伤寒病阳性牛奶样：均由北京维德维康制备、保存。

1.1.3 试剂和仪器 脂多糖（LPS）提取试剂盒：购买于iNtRON公司；布鲁氏菌全乳环状反应抗原（RAA 0048）：购自AHVLA（Animal Health and Veterinary Laboratories Agency）；PVC背板、吸水纸：购自上海良信科技有限公司；硝酸纤维素膜（NC膜）：购自上海杰一生物技术有限公司；玻璃纤维素膜：购自上海金标生物技术有限公司；滤血膜：购自杭州科百特过滤器材有限公司；葡萄球菌A蛋白（SPA）：购自艾美捷科技有限公司，鸡抗SPA：购自上海杰一生物技术有限公司；氯金酸、柠檬酸三钠：购自国药集团化学试剂有限公司；国外商品化试剂盒：购自IDEXX的布鲁氏菌牛奶抗体检测试剂盒和SVANOVA的布鲁氏菌抗体检测试剂盒。仪器包括：双显恒温磁力加热搅拌器，北京金紫光科技发展有限公司，型号SH-3；三维平面划膜仪，上海金标生物科技有限公司，型号HM 3030；斩切机，上海金标科技有限公司，型号ZQ2000；电热恒温培养箱，上海森信实验仪器有限公司，型号DRP-9082。

1.2 方法

1.2.1 LPS提取鉴定 使用LPS提取试剂盒提取LPS，同时加蛋白酶K处理，以获得更高纯度；用蒽酮法测定LPS浓度，SDS-PAGE凝胶电泳和银染试剂盒银染鉴定LPS，鲎试剂检测LPS活性。

1.2.2 免疫层析检测方法建立 通过试验数据和经验，筛选最佳金标垫、NC膜、样品垫、吸水纸、滤血膜、样品稀释液，并确定胶体金、胶体金蛋白结合物、金标垫、NC膜、样品垫等最佳处理方法，以及检测线和质控线最佳包被浓度、最佳奶样稀释度、最佳判读时间。

1.2.3 敏感性检测 使用本研究建立的布鲁氏菌抗体免疫层析方法检测50份布鲁氏菌阳性牛奶样，计算阳性检出率，同时对10份布鲁氏菌阳性牛奶样进行1∶2～1∶32连续倍比稀释后测定效价，并与全乳环状试验进行比较。

1.2.4 特异性检测 使用本研究建立的布鲁氏菌抗体免疫层析方法检测50份布鲁氏菌阴性牛奶样，计算阴性检出率，同时检测口蹄疫O型阳性牛奶样、口蹄疫A型阳性牛奶样、口蹄疫亚洲Ⅰ型阳性牛奶样、牛副伤寒病阳性牛奶样各2份，判断是否有交叉反应。

1.2.5 重复性检测 按照建立的布鲁氏菌抗体免疫层析方法，制备3批检测试纸条，批号设为201801、201802、201803。使用3批试纸条检测布鲁氏菌阴阳性牛奶样各5份，计算批间重复性；使用3盒201801批检测试纸条检测上述样品，计算批内重复性。

1.2.6 保存期检测 将3个批次的试纸条置于37 ℃的保存条件下，放置18 d，分别在0、1、2、3、6、12、15、18 d，对其性状、装量、无菌、敏感性和特异性进行检验，通过加速试验确定产品保存期。

1.2.7 符合率检测 将临床采集的262份样本，分别用建立的奶样检测试纸条、全乳环状试验、ELISA方法（SVANOVA、IDEXX）进行验证，筛选血清学检测结果均为阴、阳性的牛奶样，进行符合率验证。

2 结果

2.1 LPS提取鉴定

使用LPS提取试剂盒提取LPS后，用蒽酮法测定LPS浓度，建立标准曲线，测得LPS平均浓度为1.26 mg/mL（图1）；SDS-PAGE凝胶电泳显示无明显蛋白条带（图2），SDS-PAGE凝胶银染可见蛋白条带（图3）；利用鲎试剂检测试剂盒提取LPS并检测其活性，建立标准曲线，测得鲎试剂凝集活性为256.56±0.08（图4）。LPS浓度、纯度验证表明，制备的LPS质量良好，可用于后续检测试纸条免疫层析方法的建立。

图1 蒽酮法检测标准曲线

图2 SDS-PAGE凝胶电泳结果

图3 LPS银染结果

图4 鲎试剂检测标准曲线

2.2 免疫层析检测方法建立

根据试纸条的显色情况、扩散情况，最终确定奶样中布鲁氏菌抗体免疫层析检测的最佳方法和参数如下：胶体金制备加入氯金酸后，加柠檬酸三钠，转速600 r/min加热15 min；胶体金蛋白结合物制备标记pH为6.0，加入的SPA量为6 μL，封闭液为20% BSA，复溶液选择含有10%蔗糖、1%BSA和0.5% PVP-40的0.01 mol/L Tris-HCl溶液，标记、封闭、纯化时间均为30 min；金标垫和样品垫均选择上海金标生物技术有限公司生产的玻璃纤维膜，最佳干燥条件为37 ℃烘干16 h；NC膜型号选择CN140，最佳干燥条件为37 ℃烘干16 h；吸水纸选择上海良信生物技术有限公司的CH 27号产品；滤血膜选择Cobetter HD（1.8 μm）；检测线上LPS最佳包被浓度为1.0 mg/mL，质控线上鸡抗SPA最佳包被浓度为1.0 mg/mL，奶样最佳稀释倍数为1∶3，最佳判读时间为10～15 min。

2.3 敏感性检测

使用建立的布鲁氏菌抗体免疫层析方法，检测50份布鲁氏菌阳性牛奶样，发现其中49份为阳性，敏感性为98.0%（49/50）。10份布鲁氏菌阳性牛奶样经1∶2～1∶32连续倍比稀释后检测效价为1∶2～1∶8，均高于同等稀倍数下全乳环状试验（表1）。

2.4 特异性检测

使用本研究建立的布鲁氏菌抗体免疫层析方法，检测50份布鲁氏菌阴性牛奶样，发现48份为阴性，特异性为96.0%（48/50），口蹄疫O型阳性牛奶样、口蹄疫A型阳性牛奶样、口蹄疫亚洲Ⅰ型阳性牛奶样、牛副伤寒病阳性牛奶样检测结果均为阴性（表2）。

表1 抗体效价检测结果

表2 交叉反应检测结果

2.5 重复性检测

使用3批检测试纸条（201801、201802、201803）检测布鲁氏菌阴阳性牛奶样各5份，发现3批检测结果100%符合（表3）；使用3盒201801批检测试纸条检测上述样品，发现检测结果100%符合（表4）。上述结果说明，该试纸条批间、批内重复性均良好。

2.6 保存期检测

在37 ℃保存条件下，使用检测试纸条分别在0、1、2、3、6、12、15、18 d，对其性状、装量、无菌、敏感性和特异性进行检验。检验结果显示，37 ℃放置15 d后，检测试纸条性状、装量、无菌、敏感性和特异性均符合要求，放置18 d后，试纸条敏感性、特异性有所下降。根据加速保存期试验检测结果，将试纸条保存期定为2～30 ℃条件下保存12个月。

2.7 符合率检测

使用本研究的奶样检测试纸条、全乳环状试验、ELISA方法（SVANOVA，IDEXX）分别检测临床采集的262份牛奶样，发现66份牛奶样血清学检测（SVANOVA，IDEXX和检测试纸条）均为阳性，33份均为阴性（表5）。以筛选出的99份牛奶样为标准进行符合率验证，发现检测试纸条的阳性符合率为95.5%，阴性符合率为93.9%，总符合率为94.9%（表6）。

表3 批间重复性检测结果

表4 批内重复性检测结果

表5 不同检测方法检测结果

表6 不同检测方法与标准奶样的符合率检测结果

3 讨论与结论

本研究建立的检测试纸条敏感性为98.0%，倍比稀释检测抗体滴度为 1∶2～1∶8， 特异性为96.0%，检测试纸条与口蹄疫O型阳性奶样、口蹄疫A型阳性奶样、口蹄疫亚洲I型阳性奶样、牛副伤寒病阳性奶样均无交叉反应；对检测试纸条进行重复性检测，发现批间、批内重复性均良好；通过保存期加速试验，检测试纸条保存期暂定为2～30 ℃保存12个月。通过与国标方法与ELISA方法筛选标准奶样进行符合率检测，发现标准奶样的总符合率为94.9%。符合率验证结果显示：国标方法特异性好，但是敏感性低，不适用于布病初筛；SVANOVA试剂盒检测奶样，特异性较差，假阳性较高，会导致健康奶牛淘汰，增加饲养成本；IDEXX试剂盒敏感性、特异性较好，但相比检测试纸条检测时间较长，设备要求高。

综上所述，本研究建立的检测奶样的布鲁氏菌抗体酶联免疫方法具有敏感性高、特异性强以及方便、快捷等优点，适用于现场大批量检测，可应用于奶牛场的布病初筛。该方法的建立为我国布防控提供了技术支持。