胍盐聚合物添加量对抗菌食品包装膜抗菌性及物理性能的影响

汪 敏，赵永富※，谢洪德，金浴雅，黄 倩

（1. 农业部长江中下游设施农业工程重点实验室，江苏省农业科学院农业设施与装备研究所，南京 210014；2. 苏州大学材料工程学院，苏州 215021；3. 南京农业大学食品科技学院，南京 210095）

0 引 言

抗菌材料作为一种新兴的材料，能有效的抑制细菌的生长与繁殖，越来越受到人们的关注，抗菌材料的开发及应用在国内外有良好的发展前景。在众多抗菌剂产品中，胍类抗菌剂具有杀伤力强、毒性小、性能稳定等优点[1-2]。聚六亚甲基胍类抗菌剂分为单胍盐和双胍盐，其中双胍盐更温和，安全性更高，而盐酸盐又比其他盐类杀菌效果更好[3-4]。聚六亚甲基盐酸盐被认定为阳离子杀菌剂中抗菌效果最好的抗菌药，其性状为白色无定形粉末，没有特殊气味，不挥发，对各类表面处理无腐蚀，环境友好[5]。聚六亚甲基胍盐抗菌剂具有优越的杀菌活性，其优越性主要体现在：高效、安全、无毒副作用，对光、热稳定，不产生细菌耐药性，持久有效[6-7]。

胍盐及其衍生物被引入到高聚物结构中，所得到的胍盐聚合物具有较强抗菌性[8-9]。Zhang等[10]通过缩聚合成的胍盐，具有较好的抗细菌和真菌的效果。Guan等[11]制得含有抗菌胍盐基团的纸浆纤维，测试其对埃希氏杆菌的抗菌活性很高。Qian等[12]制备的胍盐聚合物最小抑菌浓度仅为8 mg/L，具有极强抗菌力。李旭等[13]将制备的胍盐抗菌剂添加到纸张中，提供了抗菌性能和增湿强效果。胍盐聚合物常见应用于纺织、医疗和其他日常用品的杀菌消毒，将抗菌胍盐添加于最常见的PE薄膜制备抗菌薄膜材料尚未见报道。

在食品保鲜中，相比于直接浸泡和喷洒抗菌剂，将抗菌剂添加至薄膜材料中，可以避免由于食品化学组分影响而降低抗菌剂的抗菌活性[14]。因此，在抗菌薄膜材料的研制中，可以利用聚合物的复合稳定作用，将PHMB母粒分散在聚乙烯基体中制得PHMB抗菌膜。如何制备出既具有强抗菌性能又能保持其他综合性能优良的PHMB抗菌膜，成为亟待解决的问题。本研究以不同PHMB母粒添加量的抗菌膜为研究对象，探究不同PHMB母粒添加量对薄膜的抗菌性，以及透光率、水蒸气透过率、力学性能等性能的影响，以期为抗菌材料的研制提供技术参考。

1 材料和方法

1.1 原料与试剂

低密度聚乙烯（low density polyethylene，LDPE）、高密度聚乙烯（high density polyethylene，HDPE），上海奉纳塑化有限公司生产；聚六亚甲基双胍盐酸盐（polyhexamethylene biguanidine hydrochloride，PHMB）购自常州凯乔生物科技有限公司；大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC6538均购自美国标准物质保藏中心。

PHMB抗菌母粒、抗菌薄膜均在苏州德捷膜材料科技有限公司进行加工。

1.2 PHMB抗菌薄膜的制备

1.2.1 PHMB抗菌母粒制备流程

HDPE/LDPE（1:4）基体树脂→添加PHMB→密炼→双螺杆挤出机→共混挤出造粒。

1.2.2 PHMB抗菌薄膜的制备

将PHMB抗菌母粒以0、2%、3%、4%、5%、6%、7%质量比(由预试验确定)添加到HDPE/LDPE=1∶4树脂中，混合均匀，吹膜。工艺条件：吹膜温度分别为145、155、165、175、185 ℃，挤出模头温度为 195 ℃，转速为30 r/min。制得抗菌母粒质量分数分别为0、2%、3%、4%、5%、6%、7%的聚乙烯薄膜。

1.3 PHMB抗菌薄膜的抗菌性测试

1.3.1 抗菌性能测试

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌菌悬液制备：用接种环取斜面培养菌种，于琼脂培养基上进行平板划线，37 ℃温度下培养24 h，活化完成。用接种环取活化后的菌种，用生理盐水依次配10倍递增稀释液。

杂菌菌悬液样品制备：以未经消毒清洗的青菜为供试样品。从田间采摘新鲜青菜(品种为上海青 )，立即剪碎，与生理盐水按质量比1∶1混合，研磨，用纱布过滤至烧杯中，用生理盐水依次做10倍递增稀释液。

将薄膜样品裁剪为50 mm×50 mm大小，参照标准GB/T 31402-2015[15]方法，通过贴膜法将菌液与薄膜样品进行24 h充分接触后，进行菌落培养与计数，测定薄膜的抗菌性能。大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别用对应的3M片进行计数测定。菌落总数用营养琼脂培养基进行培养测定，琼脂培养基由本实验室配制。

按下式计算薄膜的抗菌率。

式中R为抗菌率，%；B为空白对照样品平均回收菌数，cfu/片；C为抗菌样品平均回收菌数，CFU/片。

1.3.2 抗菌长效性检测

取3组抗菌膜样品、3组对照样品置于试验室台上，自然条件下储存，分别于1个月、3个月、6个月时测试抗菌率，方法同1.3.1中介绍的贴膜法。同时测定该期间的最高和最低温度。

1.4 PHMB母粒添加量对薄膜性能的影响

1.4.1 透光率

参照ASTM D1746-2015方法，将薄膜剪成9 mm×30 mm的大小，夹持于紫外可见分光光度计（UV-3200PC，上海美谱达仪器有限公司）的样品吸收池，使入射光束垂直通过膜材料，在560 nm的波长处进行扫描，测定透光率。不放薄膜时透光率为100%作为对照，每个样品平行测3组。

1.4.2 水蒸气透过率

参照 ASTM E96/E96M-2013和 GB 1037-1988[16]方法，将粒度为2 mm的无水CaCl2放入平口量杯中，至杯口3 mm处为止。然后将薄膜样品水平紧密固定于杯口，称质量后将量杯放入38 ℃，相对湿度90%的恒温恒湿箱，每隔一定时间，称量量杯的质量。每个样品平行测3组。按式（2）计算薄膜水蒸气透过率。

式中WVTR为水蒸气透过率，g/(m2·d)；Δm为t时间内的质量增加，g；S为试样透水蒸气的面积，m2；Δt为质量增量稳定后的2次时间间隔，h。

1.4.3 力学性能

将抗菌膜制备为主轴分别平行和垂直于薄膜取向方向的 2组试样，分别为样品的横向和纵向取样。样品尺寸为长150 mm、宽20 mm的矩形。断裂拉伸强度及断裂伸长率采用微机控制电子万能材料试验机（HY-0580，上海衡翼精密仪器有限公司）进行测量。测试条件：室温25 ℃，拉伸速度为300 mm/min，夹具间距为100 mm，每个样品平行测10组。

1.5 PHMB抗菌膜的保鲜试验

以未经灭菌处理的鳕鱼干片为试样，分别用普通PE膜和PHMB（4%）抗菌膜进行包装，存放7 d后，从与包装袋直接触的鳕鱼干片表层取样检测菌落总数、大肠菌群和金黄色葡萄球菌负载量。

2 结果与分析

2.1 PHMB母粒添加量对抗菌性的影响

2.1.1 大肠杆菌抑菌试验

图1为PHMB抗菌膜对大肠杆菌的抗菌效果，图2是抗菌膜中 PHMB母粒添加量与抗菌率(大肠杆菌)的关系曲线。由图1可以看出，检测空白样(图1a)和对照膜(图1b，PHMB母粒添加量为0)所用的3M大肠杆菌快速测试片的培养基底色为紫色，菌落为蓝色且呈现散点状密集分布。当在聚乙烯膜基材中添加PHMB母粒制成抗菌膜后，对应的3M快速测试片的培养基底色为紫红色，菌落为暗红色且菌落数依次减少，直至完全消失（图1g、1h）。这是因为抗菌膜上负载的大肠杆菌被杀死或生长受到抑制，从抗菌膜上洗脱下来的大肠杆菌活菌数逐渐减少的缘故。图2定量表示了抗菌膜中PHMB母粒添加量对抗菌性能即抗菌率的影响。当PHMB母粒添加量为2%、3%时，薄膜的抗菌率分别为 72.5%、85.2%。而当PHMB母粒添加量为4%时，检测到的菌落平均数为3个，薄膜抗菌率为99.1%。当PHMB母粒添加量为5%以上时，抗菌率达到99.7%。制备的抗菌膜基本抑制大肠杆菌的生长。

Nikkola等[17]利用胍盐（polyhexamethylene guanide hydrochloride ，PHMG）修饰聚乙烯醇，然后接枝到聚酰胺膜上。随着混合溶液中PHMG比例的增加，所制得的改性膜对大肠杆菌的抗菌性能相应增加。Li等[18]将胍盐与均苯三甲酰氯进行界面聚合反应制得复合纳滤膜，当用质量分数为2%时，对大肠杆菌杀菌率达100%。本试验将PHMB与聚乙烯进行共混密炼，制得的膜产品对大肠杆菌抗菌作用与上述研究结果一致。聚六亚甲基胍盐中的胍基具有较高的活性，聚合物成正电性。由于各类细菌、病毒一般呈负电性，所以很容易发生相互吸附作用，进而使细菌、病毒无法分裂繁殖，丧失活性[19]。随着PHMB母粒添加量的增加，抗菌膜中胍基含量增大，更多具有杀菌性能的胍基暴露到膜表面，导致薄膜与大肠杆菌接触机会增大，杀菌性能随之提高[20]。

图1 PHMB抗菌膜对大肠杆菌的抗菌效果Fig.1 Antibacterial effect of PHMB antibacterial film on Escherichia coli

图2 抗菌膜中PHMB母粒添加量与抗菌率(大肠杆菌)的关系Fig.2 Relationship between amount of PHMB masterbatch in antibacterial film and antibacterial rate (E. coli)

2.1.2 金黄色葡萄球菌抑菌试验

图3为PHMB抗菌膜对金黄色葡萄球菌的抗菌效果，图4是抗菌膜中PHMB母粒添加量与抗菌率（金黄色葡萄球菌）的关系曲线。观察图3，检测空白样（图3a）和对照膜(图3b，PHMB母粒添加量为0)所用的3M金黄色葡萄球菌快速测试片的培养基底色为淡黄色，菌落为紫色且呈簇状密集分布。当添加PHMB母粒制成抗菌膜后，虽然对应的3M快速测试片的培养基底色变化不大，但簇状菌落减小（图3e、3f），最终消失（图3g、3h）。说明抗菌膜上接种的金黄色葡萄球菌被PHMB杀死或生长受到抑制。由图4曲线可得，当PHMB母粒添加量为2%、3%和 4%时，薄膜抗金黄色葡萄球菌的比率分别为60.3%、72.6%和99.2%。当PHMB母粒添加量为5%以上时，抗菌率趋近100.0%。

已有研究表明，胍基聚合物对革兰氏阳性菌、阴性菌具有类似的杀菌效率[21-22]。金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，大肠杆菌为革兰氏阴性菌。本试验结果表明，当抗菌膜中PHMB母粒添加量达到4%时，PHMB抗菌膜对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌率均达到 95%以上。这是由胍类聚合物静电杀菌的共同机理所决定的[23]。可能的解释是：PHMB薄膜的杀菌效率或最低抑制浓度主要取决于其膜表面的阳电荷密度分布，其次才是细菌的类别。

图3 PHMB抗菌膜对金黄色葡萄球菌的抗菌效果Fig.3 Antibacterial effect of PHMB antibacterial film on Staphylococcus aureus

图4 抗菌膜中PHMB母粒添加量与抗菌率（金黄色葡萄球菌）的关系Fig.4 Relationship between amount of PHMB masterbatch in antibacterial film and antibacterial rate (Staphylococcus aureus)

2.1.3 杂菌抑菌试验

为了考察 PHMB抗菌膜对多种细菌的共同抑菌作用，采摘新鲜青菜（品种为上海青）以获取杂菌样品并进行抗菌试验。图5为PHMB抗菌膜对杂菌样品的抗菌效果，图6是抗菌膜中PHMB母粒添加量与抗菌率（杂菌）的关系曲线。杂菌数量检验采用活菌计数法(培养法)。由图5可见，与空白样相比，随着PHMB母粒添加量的增加，培养皿中的菌落由密集交叉变成疏离可分，当PHMB母粒添加量为4%以后，菌落总数小于10个。从图6的抗菌曲线看，抗菌膜的抗菌率随PHMB母粒添加量增多而逐渐增大。当PHMB母粒添加量为4%、5%时，抗菌率分别为 83.4%和 89.4%，具备较强的抗菌性；当PHMB母粒添加量为6%、7%时，抗菌率大于90%。

从田间采摘的新鲜青菜受土壤、肥料和水质污染，可能存有大量的大肠埃希氏菌、沙门氏菌、放线菌、霉菌和酵母菌等[24]。相对于菠菜、芹菜等其他叶菜，青菜可培养的细菌菌落数最高[25]。PHMB抗菌膜对青菜液中多种杂菌（需氧菌等）生长都具有抑制效果，说明PHMB抗菌膜具有广谱杀菌性。这是因为PHMB是阳离子聚合物，其杀菌方式是通过非特异性相互作用来实现的[26]。而PHMB抗菌膜对杂菌杀菌效率比大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌液低10%以上，可能原因是：聚胍物在低浓度时，虽有细胞内组分渗出，但细菌的形态完整；只有当浓度大于最低抑菌浓度时，细菌细胞才破解成碎片而致死。

图5 PHMB抗菌膜对菌落总数的抗菌效果Fig.5 Antibacterial effect of PHMB antibacterial film on total number of colonies

图6 PHMB抗菌膜对菌落总数的抗菌率Fig.6 Antibacterial rate of PHMB antibacterial film to total number of colonies

2.1.4 PHMB抗菌薄膜的抗菌长效性

以PHMB母粒添加量为4%的抗菌膜为试样，进行储藏试验，测试不同贮藏时间下的抗菌率变化，见图 7和图8。结果表明，存放1个月、3个月和6个月后，PHMB抗菌膜(4%)对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌率略微下降，但都高于96.9%。在6个月试验过程中，南京最高气温40 ℃，最低气温为-8 ℃，此为近10 a来南方地区气温变动的最大范围。这说明PHMB抗菌性能持久、稳定，受温度影响小。推测在自然温度条件下，抗菌膜的功能基团很少发生迁移或膜表面静电吸附性能变化不大。

图7 PHMB抗菌膜抗大肠杆菌长效性Fig.7 PHMB antibacterial film for long-term resistance to Escherichia coli

图8 PHMB抗菌膜抗金黄色葡萄球菌长效性Fig.8 PHMB antibacterial film for long-term resistance to Staphylococcus aureus

2.2 PHMB母粒添加量对薄膜使用特性的影响

2.2.1 透光率

作为食品包装材料，透光率过大会带来光照对食品品质的损坏，透光率过小薄膜表现为浑浊也影响包装品质。图9为抗菌膜中PHMB母粒添加量与透光率的关系曲线。由图可知，随着PHMB母粒添加量增大，抗菌膜的透光率逐渐升高，随后略微下降，但总体变化很小。未添加PHMB母粒的对照膜在560 nm波长下透光率为86.9%，PHMB母粒添加量为5%的抗菌膜透光率最高，达89.1%。高添加量（5%、6%、7%）比低添加量（2%、3%、4%）的 PHMB抗菌膜的透光率值波动大。这可能是因为，胍盐粉末结晶度低[27]、颗粒粒径小，填充到聚乙烯结构的孔隙中可以减少光的折射，膜的透光性能增加[28]。但当添加量增大后，团聚作用在体系内部的粒子造成光的漫反射现象变大，故造成薄膜的透光率降低，且薄膜不同微区的透光率差异增大。

图9 PHMB母粒添加量对抗菌膜透光率的影响Fig.9 Transmittance of antibacterial film with different PHMB addition amount

2.2.2 水蒸气透过率

薄膜水蒸气透过率能够反映薄膜对水分的阻隔效果。图10为抗菌膜中PHMB母粒添加量与水蒸气透过率的关系曲线。添加PHMB母粒后，抗菌膜水蒸气透过率总体呈现升高趋势，但增加不大。当PHMB母粒的添加量由0增至3%后，抗菌膜水蒸气透过率从28.86 g/(m2·d)升至 35.25 g/(m2·d)，随后趋于平缓。这可能是，因为带有极性的胍基基团存在于聚乙烯的三维结构之间，构成微细的水分子通道，有利于水汽的透过。但当PHMB母粒添加量不断增大后，由于异相成核作用，在一定程度上减弱了聚乙烯分子间的紧密排列，又对水分子的通过有一定的阻碍作用[29]。

图10 PHMB母粒添加量对抗菌膜水蒸气透过率的影响Fig10 Effects of different PHMB contents on water vapor permeability of antibacterial films

在食品保藏中，湿度过高容易促发物性变化，如受潮结晶、结块或失去脆性等，同时会促使微生物繁殖、油脂氧化、褐变和色素氧化。聚乙烯作为阻湿防潮包装材料，可以控制包装食品因脱水或吸湿而变色。添加PHMB母粒后，薄膜透湿率变化不大，仍然保持较低的透湿率，有利于食品的贮藏保鲜。

2.2.3 力学性能

食品包装材料需要有一定的强度，来抵抗运输中的破坏力。力学性能是反映包装材料这一基本使用的指标。图11显示抗菌膜中PHMB母粒添加量与拉伸强度和断裂伸长率的关系。由图11可知，在拉伸强度方面：PHMB母粒添加量为4%时，抗菌膜的横向拉伸强度达到最大值16.6 MPa，相比对照膜提高了 19.1%；但随着 PHMB母粒添加量继续增大，抗菌膜拉伸强度有所降低，但也高于对照膜。纵向方向PHMB抗菌膜的拉伸强度与横向方向上的变化趋势一致。在PHMB母粒添加量为4%时，抗菌膜纵向拉伸强度达到最大值18.5 MPa，相比对照膜提高了18.4%。断裂伸长率方面：横纵2个方向，抗菌膜的断裂伸长率均随PHMB母粒添加量的增大呈先增大后减小的趋势，但都高于对照膜。当PHMB母粒添加量为4%时，两者都达到最大值。总之，PHMB可以明显提高聚乙烯膜的力学性能。

有学者发现，添加竹粉[30]或者丙烯酸酯增容剂[31]均能将聚乙烯的拉升强度提高至17MPa左右。潘明珠等[32]将聚磷酸铵添加至秸秆-高密度聚乙烯，发现复合材料的断裂伸长率和冲击强度先增加后下降。在PHMB抗菌膜中，PHMB颗粒与聚乙烯基体之间存在一层由基体分子链吸附在胍盐颗粒表面构成的界面层[33]，PHMB颗粒和聚乙烯分子链通过界面层的作用，连接在一起形成了三维网状结构，其中PHMB颗粒起到了交联点的作用。材料受到拉伸应力作用时，交联点可以起到均匀分布应力的作用，减少了整体的破坏。因此，应力的分散作用是使得低PHMB母粒添加量时抗菌膜拉伸强度提高的主要原因。当PHMB母粒添加量增大时，由于界面缺陷增多导致界面强度降低及弱聚集体数目的增加，PHMB的拉伸强度反而降低。

图11 PHMB抗菌膜横纵方向的拉伸强度和断裂伸长率Fig.11 Tensile strength and elongation at break of PHMB antibacterial film in longitudinal and vertical directions

2.3 PHMB抗菌膜对鳕鱼干微生物生长的抑制作用

以未经消毒灭菌处理的鳕鱼干样品为试样，进行PHMB抗菌膜对实际样品抗菌试验。经检验，鳕鱼干样品的初始菌落总数为 7.1×105CFU/g，大肠菌群为 1.5×104MPN/kg，金黄色葡萄球菌为 7.5×102CFU/g。如表 1所示，普通PE薄膜包装的鳕鱼干存放7 d后，其表层菌落总数、大肠菌群和金黄色葡萄球菌活菌数分别增到2.7×106CFU/g、4.6×104MPN/kg和 1.4×103CFU/g。而采用PHMB（4%）抗菌膜包装的鳕鱼干，存放同样时间后，其表层菌落总数、大肠菌群和金黄色葡萄球菌活菌数则分别降低为 5.2×104CFU/g、3.0×102MPN/kg和 5.8×102CFU/g。

一般来说，食品表层直接与加工设备、空气、水气及生产者手部接触，污染几率较大[34]。采用PHMB抗菌膜包装食品，可以有效地抑制食品与包装接触面层的微生物生长，从而降低预处理或后续辐照[35]、微波等杀菌时间，减少加工费用，达到延长食品保质期的目标。

表1 PHMB抗菌膜对鳕鱼干（存放7 d）的抑菌作用Table 1 Antibacterial effect of PHMB antibacterial film on dried squid (stored for 7 d)

3 结 论

胍基聚合物是一种阳离子型杀菌剂，而细菌细胞膜外呈负电性，所以胍基通过与细菌细胞静电吸附作用，导致细胞膜破裂，杀死各类细菌、真菌。本研究将自制的PHMB母粒添加至聚乙烯基体中，在一定的工艺条件下制得PHMB抗菌膜。该抗菌膜在PHMB母粒添加量为0～7%范围内时，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和杂菌均具有强抗菌作用，且随着添加量的增加抗菌效应加大。当PHMB母粒添加量为4%时，抗菌膜对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌抗菌效率接近100%，且存放6个月后的抗菌效率仍维持在96.9%；对杂菌样品的抗菌率比大肠杆菌、金黄色葡萄球菌低。为进一步地验证PHMB薄膜对实际食品的抗菌性，采用该膜包装鳕鱼干，有效地控制食品接触层内的微生物生长。这说明制备的PHMB抗菌膜具有高效、广谱、持久地杀菌抗菌效果。

PHMB膜作为包装材料，必须具备一定的物理性能。上述对PHMB薄膜的测试结果表明，在PHMB母粒添加量为 0～7%范围内，薄膜透光率、水蒸气透过率基本不受影响，但力学性能以PHMB母粒添加量为4%时最优。

综合上述可以得出结论：在本试验设定聚乙烯、PHMB配方、母粒加工和吹膜工艺条件下，从PHMB膜的抗菌性和物理性能出发，PHMB母粒最适宜添加量为4%。本PHMB薄膜对杂菌样品的抗菌率明显降低，其与抗菌膜微观结构有什么关联，工艺怎样改进才能提高抗菌率还有待进一步探讨。