印度梨形孢液体发酵产物的制备及其在日本青葱上的应用

刘慧春，朱开元，张加强，谭晨，周江华，李明江，田丹青

(浙江省农业科学院 花卉研究开发中心，浙江 杭州 311202)

印度梨形孢(Piriformosporaindica)是印度科学家Verma等[1]于1998年在印度西北部的塔尔沙漠中发现的一种新生物菌，该菌能在人工培养基上培养[2]，且寄主广泛。研究发现，印度梨形孢可定殖于多种作物的根部，如拟南芥、烟草、大麦、小麦、玉米等[3-7]，甚至能够在丛枝菌根真菌(AMF)不能定殖的十字花科作物上定殖[8]，故可广泛应用于农业上。研究发现，印度梨形孢能促进植物生长，加快植物对氮、磷等矿物质的吸收，提高大麦、小麦等粮食作物产量[9-12]。因此，印度梨形孢真菌被认为是一种生物防治因子和土壤改良因子，具有广阔的科研和商业开发前景。

印度梨形孢的培养通常采用的是Kafer培养基[13]，但却适合于实验室小型试验阶段，由于生长速度较慢，不能满足生产上大批量定期定量对印度梨形孢生物菌肥的需求，因此需要通过有效手段来促进印度梨形孢的液体培养产量，同时提高代谢物的作用。本研究采用不同的培养基配方，并在印度梨形孢特定的发酵阶段加入不同来源的冷激蛋白和不同外源物，研究不同培养基配方和培养方法对提高印度梨形孢发酵产物的效果，并将获得的印度梨形孢发酵产物应用于蔬菜日本青葱的育苗阶段，研究了印度梨形孢对日本青葱的促生增产效应。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试材为日本青葱，生长于浙江省杭州市萧山区舒兰农业有限公司临江工业园蔬菜种植基地；供试菌株为印度梨形孢，由台湾大学叶开温教授惠赠；冷激蛋白的来源有3种菌株：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、大肠杆菌(Escherichiacoli)和嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)，由浙江省林科院提供。

1.2 培养基配方

PDA平板培养基。马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15～20 g，用水定容至1 000 mL，自然pH，在121 ℃下灭菌20 min。

液体种子培养基。葡萄糖5～20 g，酵母粉4 g，蛋白胨3 g，KH2PO41 g，MgSO40.5 g，定容至1 000 mL，自然pH，在121 ℃下灭菌20 min。

固体培养基。玉米粉0.3%～0.9%，牛肉浸膏0.1%～0.6%，K2HPO40.10%～0.25%，MgSO40.05%～0.15%以及余量的水，自然pH，在121 ℃下灭菌20 min。

液体发酵培养基。葡萄糖15 g，玉米粉4 g，牛肉浸膏3 g，KH2PO41.0 g，MgSO40.55 g，定容至1 000 mL，自然pH，在121 ℃下灭菌20 min。

1.3 印度梨形孢的活化培养

将斜面保藏的印度梨形孢菌种接种到PDA平板培养基上，在22～28 ℃下活化培养4～15 d，获得活化后的印度梨形孢菌种。

1.4 冷激蛋白的制备

将冷激蛋白的3种来源的菌株从37 ℃降至15 ℃分别培养1、12和20 min，将菌体放入匀浆机中，在60 MPa下匀浆2次，加入占菌体质量1%～3%的木瓜蛋白酶，在40～50 ℃下酶解1 h，3～5 ℃下12 000 rpm离心20 min，收集上清液；上清液采用截留分子质量为2～5 kD膜超滤，截留液调pH至5.0，过夜，12 000 rpm离心20 min，将离心上清液真空冷冻干燥得到蛋白样品，将其溶于0.02 mol·L-1Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液中配成20 mg·mL-1溶液，上样于葡聚糖凝胶过滤柱Sephadex G-25，用0.01 mol·L-1Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液洗脱，流速0.5 mL·min-1，每管收集2 mL，自动收集洗脱液并于紫外280 nm检测并收集组分，通过真空冷冻干燥得到来源于不同菌株的冷激蛋白。

1.5 发酵产物的制备

1.5.1 液体种子液

取1～3 cm2大小活化后的印度梨形孢菌种接种于1 L液体种子培养基中，在22～24 ℃培养1～9 d，得到印度梨形孢液体种子液。

1.5.2 固体发酵培养

将1.5.1中印度梨形孢液体种子液按占固体培养基体积5%～15%的用量接入添加有外源物的固体培养基中，在18～28 ℃下培养1～15 d后，将培养产物真空冷冻干燥、粉碎后得外源物固体发酵培养物；外源物分为3种：生地和栀子经粉碎后得到的生地小块和栀子小块、生地经粉碎后得到的生地小颗粒、栀子粉碎后的栀子粉末；每升固体培养基中添加不同量的外源物。

1.5.3 液体发酵培养

将1.5.1中印度梨形孢液体种子液按占液体发酵培养基体积3%～12%的量接种于添加有外源物固体发酵培养物的液体发酵培养基中，在18～28 ℃下培养1～5 d后加入不同来源的冷激蛋白，然后调整温度在15～25 ℃继续培养1、5和12 d，终止发酵后，得到印度梨形孢发酵产物。液体发酵培养基中外源物固体发酵培养物的添加量为0.8～9.0 g·L-1，液体发酵培养基中冷激蛋白的添加量为0.2～5.0 mg·mL-1。

1.6 生物量测定

对照和处理各3个重复，每个重复取1 L印度梨形孢的发酵产物进行过滤，将过滤后的菌丝体沥干后称重，获得的菌丝体重量即为印度梨形孢发酵产物的生物量(g·L-1)，最后取平均值。

1.7 发酵产物在日本青葱上的施用

将印度梨形孢发酵产物进行过滤、沥干并称重，称取3 g菌丝体加入到盛有500 mL水的榨汁机中，炸碎直至肉眼看不到絮状菌丝体，然后定容至1 L。稀释10倍后喷施到日本青葱幼苗上，以喷施清水作为对照，每周喷施1次，2个月后调查统计日本青葱的葱管数、株高、根系数、鲜重、干重等各项形态指标。

2 结果与分析

2.1 不同培养基配方和制备方法对印度梨形孢生物量的影响

将不同的培养基配方和制备方法获得的印度梨形孢发酵产物进行生物量测定，获得如表1的结果。

从表1可以看出，与常规培养方法(对照)相比，采用本研究方法(处理)发酵培养的印度梨形孢生物量分别提高56.0%、81.5%、66.9%、59.5%和80.0%，均达到极显著差异。在本研究制备方法限定的范围内，各参数的变化并不影响印度梨形孢液体发酵代谢产物产量的提高，因此本研究制备方法中任意参数的组合均可实现印度梨形孢液体发酵代谢产物产量的提高，其中尤以处理2效果最好，在生物量提高的同时，其生长周期缩短24 d。

2.2 印度梨形孢发酵产物对日本青葱生长的影响

以处理2的培养基配方和制备方法，培养和制备印度梨形孢的发酵产物，并将获得的印度梨形孢菌体经炸碎、稀释后，喷施到日本青葱的幼苗上。从葱播种后1周开始喷施，每周施用1次，2个月为1个周期，其他正常管理，以清水作为对照。喷施8次后，从田间随机取样，对照和处理各取2组，每组30株，进行调查，调查指标包括株高、茎干直径、葱管数、根系数、根系长、鲜重和干重等。

从图1可以看出，印度梨形孢能够明显促进日本青葱的营养生长，与对照相比，无论是株高、茎干直径还是葱管数都得到明显提高。

表1 不同培养基配方及制备方法下印度梨形孢的生物量

注：1：PDA培养基；2：液体种子培养基；3：固体培养基；4：液体种子液；5：固体发酵；6：液体发酵；7：生物量测定。

A，经粉碎后得到的生地小块；B，粉碎后的栀子小块；C，粉碎后的生地小颗粒；D，粉碎后的栀子粉末；E，粉碎后的生地糊；F，粉碎后的栀子糊。a，枯草芽孢杆菌；b，大肠杆菌；c，嗜热链球菌。

图1 印度梨形孢对日本青葱生长的影响

从表2也可以更加明确地看出，喷施过印度梨形孢的日本青葱各项生长指标均比对照高，其中株高分别比对照高出5.8%和16.9%，茎干直径分别比对照高出16.1%和34.3%，葱管数分别比对照高出32.4%和43.3%，根系长分别比对照高出6.9%和7.0%，根系数分别比对照高出20.2%和22.7%。

喷施印度梨形孢能明显提高日本青葱的产量(表3)，单株鲜重和30株鲜重分别比对照要高出51%和43%，每667 m2最高可增产600 kg。

表2 印度梨形孢对日本青葱生长指标的影响

表3 印度梨形孢对日本青葱产量的影响

3 讨论

来源于沙漠的印度梨形孢是具有多种生物功能的内生真菌，在农业生产上具有潜在的应用价值。印度梨形孢最经典的培养基是Kafer培养基，然而印度梨形孢在该培养基上生长速度较慢，并不能满足生产上大批量定期定量的对印度梨形孢的需求。为了提高印度梨形孢的生长速度，急需对其培养基配方和培养条件进行优选和改良。有研究通过在Kafer培养基中加入蛋白胨和酵母提取物等来提高印度梨形孢的生物量[14]。另外，碳源对印度梨形孢的生长也非常重要，一般利用多糖作为碳源，其中葡萄糖为最佳碳源[15]。本研究以葡萄糖作为碳源，并在培养基中加入蛋白胨、酵母粉和牛肉浸膏等附加物，促进印度梨形孢的生长速度。

冷激蛋白(cold shock domain proteins，CSPs)是广泛存在于生物体中的一种应激蛋白，在细菌、植物与动物中均有发现，是一类高度保守的核酸结合蛋白，其通过RNA分子伴侣活性参与转录、翻译、生长发育及逆境胁迫应答等细胞生理活动，从而达到一定的细胞增殖作用[16]。本研究根据印度梨形孢代谢产物合成代谢途径的特点，利用生地、栀子中的有效成分，经印度梨形孢固体发酵和液体发酵工艺，并在特定的发酵阶段添加冷激蛋白，一方面提高了印度梨形孢的生物量，另一方面缩短了印度梨形孢的制备周期，相比常规法，其生物量提高55.99%～81.51%，生长周期缩短12～26 d。

Verma等[17]报道，印度梨形孢对寄主植物玉米、烟草等均有促生作用。近几年，也有关于印度梨形孢对农作物产生促生增产作用的报道。例如印度梨形孢能够定殖于小白菜、水稻、油菜等农作物[18-20]，促进这些作物的生长，并达到增产的效果。究其原因，可能是由于印度梨形孢定殖于植物根系后，能够调节寄主植物根系内源激素如GA含量的增加，进而促进根系的生长，根系生长旺盛了，对营养的吸收加强、对逆境的抵抗力也增强，从而起到促进植物生长并达到增产的作用。印度梨形孢自身也能产生分泌物质，如A-淀粉酶和蛋白酶，这些分泌物质能够促进植物的生长[14]。本研究印度梨形孢的发酵产物中，也有其分泌的激素和蛋白，这些均可能是促进日本青葱营养生长的有益物质，具体有待进一步展开深入的研究。