富氢盐水对大鼠肠缺血再灌注凝血功能的影响

范 馨，杜 娟，杨 博，周 军

（西南医科大学附属医院麻醉科，四川泸州 646000）

机体凝血功能受到促凝系统、抗凝系统和纤溶系统的共同调节，生理状态下三大系统协调工作，维持凝血功能稳定，不会形成血栓或者出现出血倾向。当机体面临炎症打击、缺血缺氧、酸中毒、细菌病毒感染等情况时，凝血功能出现异常，诱发出血或血栓形成，可能出现DIC、MODS等严重后果[1-3]。研究发现，肠缺血再灌注会损伤肠、肝、肾、脑、肺等器官乃至出现全身多器官功能衰竭[4]，还会激活凝血系统[5]，而对于肠缺血再灌注后凝血功能的具体变化鲜有研究。近年来，关于氢气和富氢盐水的研究涉及到各种疾病，它对缺血再灌注、脓毒血症、糖尿病、肝性脑病、痴呆、急性肺损伤等均有治疗作用，能显著减弱肠缺血再灌注对器官组织的伤害，保护器官功能[6-10]。但关于富氢盐水对大鼠肠缺血再灌注后凝血功能的影响少有报道，因此本实验通过建立大鼠肠缺血再灌注模型，予以富氢盐水干预，观察大鼠凝血功能变化。

1 材料与方法

1.1 实验动物与器材

实验动物：西南医科大学实验动物中心提供清洁级成年雄性SD大鼠32只，体重220～250 g，许可证号为SYXK（川）2018-065，所有操作均经西南医科大学伦理委员会审查并同意。主要实验试剂与器材：1∶9枸橼酸钠抗凝管，全自动凝血仪Stago-evolution（北京斯塔高公司），光学显微镜（日本Olympus公司），富氢盐水（青岛泛润经贸有限公司）等。

1.2 实验动物分组

将32只SD大鼠随机分为4组，每组8只：生理盐水对照组（C组），富氢盐水对照组（H组），肠缺血再灌注组（R组），富氢盐水处理组（R+H组）。

1.3 造模取材

造模参照本课题组既往研究[11]，如在实验过程中遇大鼠造模失败或意外死亡，则补足大鼠后再行造模。大鼠造模前禁食12 h，自由饮水。称重后经腹腔注射1%戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉。备皮消毒，在剑突下1 cm处，沿腹正中线开腹，寻找肠系膜上动脉（SMA）并充分暴露。C组和H组仅暴露SMA不夹闭，R组和R+H组用无创动脉夹夹闭SMA。R组和R+H组在肠缺血持续90 min后，再次开腹，松开动脉夹，恢复血供，造成缺血后再灌注。在再灌注开始前10 min经尾静脉注射富氢盐水（10 mL/kg），生理盐水（10 mL/kg）通过同样的方式给予。造模完成后取距回肠末端5 cm处小肠段1 cm，并经腹主动脉取血3 mL。

1.4 小肠黏膜病理学形态变化

小肠段经4%多聚甲醛固定12 h后，包埋切片，行HE染色，在光学显微镜（×200）下观察小肠黏膜，并根据改良Chiu's评分评价损伤程度。评分标准如下：正常绒毛和腺体为0分；部分绒毛顶部改变，上皮下Gmenhagen腔开始形成为1分；上皮下Gmenhagen腔开始形成，腺体轻度损伤为2分；上皮下间隙增大，毛细血管充血为3分；上皮与固有层中度分离，腺体损伤为4分；部分顶部绒毛脱落为5分；绒毛脱落明显，毛细血管扩张为6分；固有层绒毛脱落，腺体损伤明显为7分；固有层开始消化、分解为8分；出血、溃疡为9分[12]。

1.5 凝血功能检测

血液标本用1∶9枸橼酸钠抗凝管收集，在室温静置30 min后离心（3 000 r，10 min），取上清液（血浆）于1.5 mL EP管中，2 h内在全自动凝血仪上机检测以下凝血功能指标：凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、血浆凝血酶时间（TT）、纤维蛋白原（FIB）、凝血酶原时间国际标准化比值（PT-INR）。

1.6 数据处理及统计学分析

用SPSS 17.0统计学软件进行分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多个样本均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小肠黏膜病理学形态变化及Chiu's评分

与C组相比，R组及R+H组小肠黏膜损伤程度明显加重，Chiu's评分明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；R+H组与R组比较，小肠黏膜损伤程度减轻，Chiu's评分降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；H组与C组相比，Chiu's评分没有明显差异（P＞0.05）。光镜下观察到的各组小肠黏膜如图1所示。

图1 各组大鼠小肠黏膜病理变化（HE染色，×200）及Chiu's评分

2.2 血浆PT、APTT、FIB、TT、PT-INR变化

各组大鼠凝血功能如图2所示，R组及R+H组PT、APTT、TT时间均较C组延长，FIB水平降低，PT-INR值升高，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；与R组相比，R+H组PT、APTT、TT时间缩短，FIB水平升高，PT-INR值降低，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；H组和C组相比，以上指标无明显差异（P ＞ 0.05）。

图2 各组大鼠凝血功能相关指标比较

3 讨 论

正常机体中，促凝系统、抗凝系统和纤溶系统保持动态的生理平衡，一旦这种平衡被打破，凝血功能便会出现异常，可能形成血栓，亦可出现出血；若凝血功能紊乱持续不能得到纠正，凝血因子耗竭，血小板大量减少，可能出现失血性休克，也可导致弥散性血管内凝血（DIC），损害心、肺、肝、肾、脑等多个器官，出现多器官功能障碍综合征（MODS），严重者死亡[1-2]。研究发现，病理状态下凝血功能异常与炎症反应关系密切，不同炎症状态下，凝血功能异常程度不同[13]。因此，在各种临床疾病诊疗过程中，维持凝血功能正常非常重要。

在临床工作中，医生对凝血功能的关注首要有以下几个基础指标：凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、血浆凝血酶时间（TT）、纤维蛋白原（FIB）、凝血酶原时间国际标准化比值（PT-INR）。PT和APTT代表凝血系统功能，分别反映外源性和内源性凝血系统功能，二者时间延长提示出血可能，缩短提示高凝状态；TT和FIB代表纤溶系统功能，变化方向通常相反，FIB水平升高时提示高凝，降低提示出血倾向；PT-INR值在临床上主要用于监测抗凝药物使用后凝血功能的变化，当其值高于4.0时，提示血液凝固需要很长时间，可能引起无法控制的出血。而INR值低于2.0时不能提供有效的抗凝，提示抗凝药物也许需要调整[14]。INR大于正常值（0.8～1.2），可能出现出血征象，需警惕出血风险。

肠缺血再灌注在临床上常见，多由于腹主动脉瘤、小肠移植等手术因素或是肠系膜血栓栓塞、失血性或感染性休克、严重烧伤等疾病因素诱发，炎症反应是其病理生理机制中关键的一个环节[15]。在本实验中，肠缺血90 min后再灌注2 h，小肠黏膜绒毛脱落，腺体损伤明显，固有层充血水肿，表明造模成功。大鼠肠缺血再灌注后，凝血功能的变化表现为PT、APTT、TT的时间延长，FIB水平降低，PT-INR值增大，有出血倾向。

氢气，自然界中存在的最小气体分子，具有易得到、无毒性、价格低廉的特点。自2007年报道氢气具有抗氧化能力以来，它被应用于各种疾病的基础实验及少数临床实验中，故而发现其还具有抵抗炎症、抑制凋亡、细胞保护等作用[9,16]。研究发现，氢气对全身各大系统均有保护作用，如吸入氢气可以缓解痴呆病情发展、依赖Akt/GSK3β信号通路减弱心肌缺血再灌注损伤、改善代谢综合征、治疗肺动脉高压、治疗肺吸虫诱导的慢性肝炎、抗癌等[10,17-20]，富氢盐水是氢气溶解于生理盐水中所得，和氢气具有相同功能。有研究说明富氢盐水经腹腔注射，对脑缺血再灌注损伤的动物模型具有神经保护作用，效果和吸入氢气相似[8]。在本实验中，富氢盐水干预大鼠肠缺血再灌注模型后，小肠黏膜损伤减轻，凝血功能指标变化减小，凝血功能异常得到一定程度的纠正，减小了出血风险。而富氢盐水对凝血功能正常的大鼠，不影响其凝血功能。

4 结论

在大鼠肠缺血再灌注后，小肠黏膜损伤严重，凝血功能发生改变，有出血倾向，富氢盐水可以减轻小肠黏膜病理变化，并改善凝血功能异常状态，减小出血风险。但本研究仍存在不足之处，如小肠黏膜损伤程度与凝血功能异常程度相一致，那么两者之间是否会存在相关性，以及富氢盐水改善肠缺血再灌注后凝血功能异常的具体机制均有待进一步探讨。