miR-132、GPC3在乙肝相关肝癌患者中的表达及意义

杨启 吕新远 王哲

肝癌是较常见的恶性肿瘤之一，约80%肝癌患者合并乙型肝炎和肝硬化。有研究显示[1-2]，约70%～80%乙肝相关肝癌患者确诊时已为中晚期，其5年生存率极低，约为20%。早期评估乙肝相关肝癌病情及预后并采取针对性治疗是提高其生存率的关键所在。近年来，虽然用于乙肝相关肝癌诊断的肿瘤标志物有所增多，但尚无一种公认度、敏感度和特异性均较高的可用于评价其病情、疗效及预后的肿瘤标志物。多项肿瘤标志物联合检测将成为乙肝相关肝癌病情评估和预后判断的趋势。本研究分析乙肝相关肝癌患者血清微RNA-132(miR-132)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)水平，评估其在乙肝相关肝癌患者病情、疗效和预后评估中的价值，以期为乙肝相关肝癌的治疗提供参考。

资料和方法

一、 一般资料

前瞻性选取2015年2月至2017年2月我院就诊的53例乙肝相关肝癌患者(乙肝相关肝癌组)、49例乙肝肝硬化患者(乙肝肝硬化组)、31例乙型肝炎患者(乙肝组)及40名健康体检者(健康对照组)作为研究对象。乙肝相关肝癌组中男性35例，女性18例，年龄32～68岁，平均年龄(54.3±6.7)岁，均符合中华人民共和国卫生部颁布的2011版《原发性肝癌诊断指南》[3]中的相关标准，临床病理资料详见表3。53例乙肝相关肝癌患者中，23例患者采用微波消融术治疗、21例行根治性手术治疗、6例行肝动脉栓塞化疗术治疗、3例患者采取靶向治疗。乙肝肝硬化组中男性29例，女性20例，年龄31～67岁，平均年龄(52.5±7.3)岁；乙肝组男性18例，女性13例，年龄28～62岁，平均年龄(53.6±6.9)岁；均根据2010版《慢性乙型肝炎防治指南》[4]进行诊断。健康对照组男性25例，女性15例，年龄28～66岁，平均年龄(54.7±5.8)岁。纳入标准：①乙肝相关肝癌患者、乙肝肝硬化患者和乙型肝炎患者均为初诊患者；②不合并其他严重疾病，如心力衰竭、慢性肾功能衰竭等。排除标准：①孕妇及哺乳期妇女；②HIV感染患者；③其他类型肝病患者；④合并其他恶性肿瘤患者。本研究四组患者在性别(χ2=0.737，P=0.865)、年龄(t=0.952,P=0.416)方面比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经我院医学伦理委员会批准，且所有受试者均签署知情同意书。

二、 方法

收集乙肝相关肝癌患者的性别、年龄、肿瘤直径、分化程度、TNM分期、甲胎蛋白水平和门静脉癌栓等临床病理资料。检测并记录治疗前乙肝相关肝癌患者、乙肝肝硬化患者、乙型肝炎患者和健康对照者血清miR-132、GPC3表达水平及乙肝相关肝癌患者治疗1个月后血清miR-132、GPC3水平等。通过影像学成像、患者状况改善程度及肝功能情况评价乙肝相关肝癌患者治疗1个月后的临床疗效。对53例乙肝相关肝癌患者进行为期1年的电话随访，观察其1年生存情况。

三、 观察指标

抽取四组受试者空腹静脉血10 mL，3500 r/min离心10 min,取上层血清，放置于-80℃环境中，待测。采用酶联免疫吸附法检测受试者血清GPC3蛋白水平(试剂盒购自Blue Gene公司)。采用化学发光法检测血清甲胎蛋白水平(试剂盒及化学发光免疫分析仪均购自美国雅培公司)。采用RT-PCR法检测血清中miR-132表达水平。首先用miRNeasy Mini Kit提取分离试剂盒(德国QIAGEN公司)提取血清中总miRNA,当A260/A280介于1.8～2.0时，继续后续操作。将总RNA逆转录成cDNA,反应条件为16℃ 15 min,42℃ 1 h，85℃ 5 min。使用TaqMan microRNA Assay检测血清miR-132的水平。用2-△Ct计算血清miR-132的表达水平，△Ct=Ct(miR-132)-Ct(U6)。miR-132、内参U6引物序列均由上海吉凯基因化学技术有限公司提供。miR-132:上游5′-GCCGATAACAGTCTACAGC-3′,下游5′-CAG-TGCAGGGTCCGAGG-3′;U6:上游5′-GTGCGT-GTCGTGGAGTCG-3′,下游5′-AACGCTTCACG-AATTTGCGT-3′。相关检测步骤严格遵从试剂盒及仪器说明书。

四、 统计学方法

结 果

一、 miR-132、GPC3在四组受试者血清中的表达

四组受试者血清中miR-132、GPC3水平比较，均差异有统计学意义(H=141.228、F=19.859，均P<0.001)。乙肝相关肝癌组患者血清miR-132水平低于乙肝肝硬化组、乙肝组和健康对照组，差异有统计学意义(U=-32.053、-82.088、-115.979，均P<0.05)。乙肝相关肝癌组患者血清GPC3水平高于乙肝肝硬化组、乙肝组和健康对照组，差异有统计学意义(Q=6.474、8.090、9.890，均P<0.05)。详见表1。

表1 四组受试者血清中miR-132、GPC3水平[M(Q1,Q3),]比较

注：与健康对照组比较，①P<0.05；与乙肝组比较，②P<0.05；与乙肝肝硬化组比较，③P<0.05

二、 血清miR-132、GPC3与乙肝相关肝癌患者临床病理的关系

乙肝相关肝癌患者血清miR-132表达水平与肿瘤分化程度、TNM分期、甲胎蛋白水平和门静脉癌栓有关(P<0.05)，与患者的年龄、性别和肿瘤直径无关(P>0.05)。血清GPC3表达与患者性别、年龄、肿瘤直径、分化程度、TNM分期、甲胎蛋白水平和门静脉癌栓均不相关(P>0.05)。详见表2。

三、 乙肝相关肝癌患者治疗前及治疗1个月后血清miR-132、GPC3的动态变化

53例乙肝相关肝癌患者中，38例患者经微波消融术、手术、肝动脉栓塞化疗术或靶向治疗后有效，肿瘤组织变小、患者状况改善，肝功能恢复。38例乙肝相关肝癌患者血清miR-132水平升高，较治疗前比较[3.8(1.9,5.5)对 1.1(0.9,1.4)×102]，差异有统计学意义(Z=-3.663，P<0.001)；GPC3水平降低，较治疗前比较[(1.4±0.3)对(1.7±0.7)ng/mL]，差异有统计学意义(t=-3.563，P=0.001)。

四、 乙肝相关肝癌患者1年生存情况

通过1年的电话随访得知，53例乙肝相关肝癌患者死亡13例，占24.5%，存活40例，占75.5%。

五、 血清miR-132、GPC3在不同预后乙肝相关肝癌患者的表达

乙肝相关肝癌生存组患者血清miR-132水平较死亡组患者高[1.2(1.0,2.0)对0.9(0.7,1.1)×102]，差异有统计学意义(Z=3.118，P=0.002)；GPC3水平低于死亡组患者[(1.7±0.6)对(2.2±0.8) ng/mL]，差异有统计学意义(t=2.646，P=0.011)。

表2 血清miR-132、GPC3与乙肝相关肝癌患者临床病理资料的关系

六、 血清miR-132、GPC3预判乙肝相关肝癌患者预后的价值

血清miR-132诊断乙肝相关肝癌患者预后的最大约登指数为0.398，其所对应的最佳截断点为1.2；血清GPC3诊断乙肝相关肝癌患者预后的最大约登指数为0.417，其所对应的最佳截断点为2.0 ng/mL。虽AUC miR-132>AUC GPC3、AUC联合检测>AUC miR-132，但均差异无统计学意义(Z=0.575，P=0.565；Z=1.698，P=0.089)；AUC联合检测>AUC GPC3，差异有统计学意义(Z=2.412，P=0.016)。详见图1及表3。

图1 miR-132、GPC3及联合检测预判乙肝相关肝癌患者预后的ROC曲线

表3 miR-132、GPC3及联合检测预判乙肝相关肝癌患者预后的效能

讨 论

目前，我国肝癌患者病死率较高，仅次于胃癌和肺癌。随着医学检验技术的发展，越来越多的肿瘤标志物被用于肝癌病情评估及预后诊断。有研究显示[5-7]，miR-132可抑制肝癌细胞增殖和转移，且与肝癌患者预后存在关联；GPC3在正常和良性肝病肝细胞中不表达，其诊断肝癌的特异性较高。关于miR-132、GPC3的研究多数为组织学研究，鲜有血清学研究。因此，笔者检测乙肝相关肝癌患者血清miR-132、GPC3表达水平，分析其与临床病理资料的关系并观察其1年生存情况，验证其在乙肝相关肝癌病情、疗效评估和预后诊断的价值。

研究表明[8]，miR-132在肝癌组织中低表达，其在肝癌中发挥抑癌作用。本研究结果显示，乙肝相关肝癌患者血清miR-132水平下降，其原因可能是乙肝相关肝癌患者肝癌细胞内miR-132表达减少，因此释放到血液中的miR-132也随之减少。本研究结果表明，乙肝相关肝癌患者血清miR-132表达水平与肿瘤分化程度、TNM分期、甲胎蛋白水平和门静脉癌栓有关，与沙敏等[9]研究结果一致。GPC3高表达于肝癌组织，其可锚在细胞表面，调控其增殖、分化和转移等[10]。本次研究中，乙肝相关肝癌患者血清GPC3表达水平最高，与乙肝肝硬化患者、乙型肝炎患者及健康对照者比较，均差异有统计学意义。通过分析乙肝相关肝癌患者血清GPC3水平与临床病理资料的关系发现，其与患者性别、年龄、肿瘤直径、分化程度、TNM分期、甲胎蛋白水平和门静脉癌栓均不相关，与多数学者研究结果一致。通过检测经手术、微波消融术、肝动脉栓塞化疗术或靶向治疗后有效的乙肝相关肝癌患者血清miR-132、GPC3水平，发现治疗后血清miR-132表达水平升高，GPC3表达水平降低，提示血清miR-132、GPC3均可用于乙肝相关肝癌患者临床疗效评估。进一步验证血清miR-132、GPC3预判乙肝相关肝癌患者预后的价值，结果表明，GPC3诊断乙肝相关肝癌患者1年后死亡的敏感度为69.2%，特异性为72.5%，临床价值较低。miR-132诊断乙肝相关肝癌患者1年后死亡的敏感度为92.3%，特异性为47.5%。miR-132和GPC3联合检测可提高乙肝相关肝癌患者预后诊断的效能。血清miR-132和GPC3检测具有方便、快捷、无创且依从性高等特点，有助于了解肝癌患者病情、疗效及预后评估。

本研究属于单中心研究，样本量偏少，下一步将扩大样本量，进行多中心研究并验证本实验结果的准确性。