200例稽留流产绒毛染色体的间期FISH分析

刘丹，丁翔，唐国栋，王燕春

(北京市海淀区妇幼保健院，北京 100080)

稽留流产是一种特殊但常见的自然流产，其发病率逐年增加。除了遗传和子宫畸形等解剖学因素外，染色体异常是早期最常见和最重要的原因[1]。目前，临床实践中最常用的基因诊断技术是分析染色体G带的核型分析技术、细菌人工染色体标记-磁珠分离法(BoBs)分子诊断技术和荧光标记的原位杂交技术(FISH)。近年，随着染色体检测技术的发展，间期FISH克服了对样本要求较高、细胞培养周期长、失败率高等缺点成为具有快速、准确、灵活特征的新型检测方法。本研究中回顾性分析2016年1月至2018年9月在我院接受治疗的稽留流产患者的绒毛组织进行了间期FISH检测，并将结果报告如下。

一、资料与方法

1.研究对象：收集2016年1月至2018年9月在我院门诊就诊和病房住院的患者，纳入标准：行B超检查、血HCG和孕酮联合检测诊断为“稽留流产”、胚胎或胎儿已死亡滞留宫腔内未能及时自行排出需接受手术治疗并要求检测绒毛染色体的患者；身心健康，月经规律；血清检查TORCH感染阴性；妊娠以来未使用过激素类药物；无烟酒爱好、无接触X射线和有毒物质的过去史；无子宫畸形。排除一些基础性疾病史，如糖尿病、免疫系统疾病、精神疾病、遗传性疾病等。共纳入200例稽留流产患者。所有患者在进行相关检查前均充分知情同意，并签署相关知情同意书。

2．试剂和仪器：主要实验试剂均购自北京博奥生物有限公司和北京益利精细化学品有限公司。相关试剂：缓冲贮存液：20×SSC，PH 5.3，用去离子水稀释至500 ml，2～8°保存；缓冲液：2×SSC，PH(7.0±0.2)；变性液：70%(v/v)甲酰胺/2×SSC；乙醇溶液(70%乙醇、85%乙醇)；甲酰胺洗涤液：50%(v/v)甲酰胺/2×SSC；洗涤液：0.1%NP-40/2×SSC溶液，PH(7.0±0.2)；快洗洗涤液：0.3%NP-40/0.4×SSC溶液，PH 7.0～7.5；KCl低渗溶液(0.075 mol/L KCl)；固定液(甲醇∶冰乙酸体积比3∶1)；5 mg/ml DAPI复染剂母液(购自北京金菩嘉医疗科技有限公司)，0.2 μg/ml DAPI复染剂母液。

FISH探针：购自北京金菩嘉医疗科技有限公司。探针包括基因位点特异性探针和着丝粒特异性探针，分为3组：(1)GLP 13/GLP 21(DLEU2位点，标绿色；DSCR2位点，标红色)；(2)GLP 16/GLP 22(CBFB位点，标红色；BCR位点，标绿色)；(3)CSP 18/CSP X/CSP Y(18号染色体着丝粒，标天蓝色；X染色体着丝粒，标绿色；Y染色体着丝粒，标红色)。在42℃环境中，这些单链样本和探针核酸根据碱基互补配对的原理特异性结合。正常细胞分别显示2个DLEU2、DSCK2、CBFB、BCR基因座信号和2个18号、2个X或1个X、1个Y着丝粒信号。如果信号变化数目异常，则表明该标本染色体数目为非正常。

3.实验方法及判断标准：手术治疗后取0.5 mg绒毛组织置于15 ml尖底离心管内，用剪刀剪碎，盐水冲洗，离心去上清，60%的冰醋酸3～4 ml混匀，消化5 min，固定液固定，滴片，老化玻片，将该玻片于胃蛋白酶消化后漂洗5 min，依次置于预冷的70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中进行梯度脱水3 min。将7 μl杂交缓冲液、1 μl去离子水和1 μl探针依次加至离心管中。离心1～3 s，混合涡旋后再次短暂离心。在(73±1)℃水浴锅中持续变性5 min，置于45～50℃水浴，杂交前取出。为了避免气泡，将该玻片置于预热的湿盒内并在42℃培养箱内杂交过夜。甲酰胺洗涤玻片。

判断标准：探针1：GLP 13/GLP 21正常信号类型：单元显示2个绿色信号(DLEU2站点)和2个红色信号(DSCR2站点)；异常信号类型：细胞显示单个或者3个及3个以上绿色信号和/或红色信号。探针2：GLP 16/GLP 22正常信号类型：细胞显示两个红色信号(CBFB位点)和两个绿色信号(BCR位点)；异常信号类型：细胞显示单个或者3个及3个以上绿色信号和/或红色信号。探针3：CSP 18/CSP X/CSP Y正常信号类型：细胞显示两个天蓝色信号(染色体18上的中心体)，2个绿色信号(X染色体着丝粒位点)(雌性)或2个天蓝色信号(中心体18个着丝粒)，1个绿色信号(X染色体着丝粒位点)，1个红色信号(Y染色体着丝粒位点)(雄性)；异常信号类型：细胞显示单个或者3个及3个以上天蓝色信号，和/或出现非正常数目情况下的绿色和/或红色信号。

随机计数100个细胞，超过90%显示正常类型提示为正常样本；超过60%的细胞显示异常信号类型，视为样本异常。

二、结果

研究共纳入200例患者，年龄22～47岁，孕周6～13周。200例绒毛组织样本的间期FISH均获得杂交信号，其中112例(56.00%)杂交结果异常标本中：常染色体单体2例，占1.79%(2/112)；常染色体三体型72例，占64.29%(72/112)；性染色体单体型19例，占16.96%(19/112)；性染色体三体型2例，占1.79%(2/112)；三倍体10例，占8.93%(10/112)；四倍体、嵌合体各1例，分别占0.89%(1/112)；其他5例，占4.46%(5/112)。具体间期FISH图象和核型资料详见图1、表1。

三、讨论

稽留流产目前是全球临床妊娠最多见的并发症之一，随着人们生活节奏越来越快，工作压力、精神压力不断增高以及环境的不断恶化，该患病率逐年呈上升趋势，不可避免地影响夫妻心身健康和家庭幸福感。寻找流产原因及指导下次妊娠成为当下亟待解决的问题及科研热点。非整倍体是影响胚胎健康发育的主要因素[2]。染色体数目改变可导致胚胎发育异常、流产死产增加，即使正常分娩，个体发育容易出现性别发育障碍等问题。本研究中，200例稽留流产样本中检测到112例异常，检出率为56.00%，与之前文献[3]报道的50%以上相似，表明绒毛染色体的核型异常可能是导致胎停育的主要原因。但由于方法学限制，间期FISH只可检测出染色体13、16、18、21、22、X和Y的数目异常，无法检测染色体结构再次重排和变异的异常。本研究检测到的异常类型中最常见的为常染色体三体。其中，16位和22位的三体最多，表明16和22三倍体可能是导致胚胎停育的高发类型，其次是21号三体。常染色体单倍型仅2例，因为单倍型具有低存活率，其少见于妊娠早期的生化妊娠。三倍体异常可以来自新的突变，或者配子在减数分裂过程中不分离，或者受精过程中分离异常[4]。这种异常类型通常在妊娠8周之前终止，并且关于纯三倍体活婴报道很少。其次是21例性染色体畸变，除2例性染色体三体外，其余19例均为特纳(Turner)综合征。45，X单体是人类唯一能生存的单体综合征，患者第二性征发育不全且伴有原发性闭经[5]。其异常核型包括：(1)45，XO，是最多见的一型，95%的胚胎发生自然流产，只有少数幸存，且具有较为典型的特殊临床表现；(2)45，XO/46，XX即嵌合型，约占Turner综合征的25%；(3)46，Xdel(Xp)或46，Xdel(Xq)，即一条X染色体的短壁或长臂缺失；(4)46，Xi(Xq)：即一条X染色体的短臂已缺失，形成等臂染色体[6]。

图1 112例异常染色体核型间期FISH检测结果示例

染色体的数目及结构异常是稽留流产的主要原因之一[7]。由于FISH检查本身的局限性，本研究未能对染色体结构异常进行检测。自然流产是生物进化中异常生命体自然淘汰的过程，是人类生殖过程重要的优生选择机制。此外，精神压力，包括过度紧张、焦虑、恐惧、悲伤，甚至噪音影响[8]；流产次数[9]；遗传基因缺陷：例如，夫妇的年龄、一方的染色体变异、夫妻的血型等[10]；不良生活习惯：如过度吸烟、酗酒、过量咖啡、海洛因等；环境因素，如空气污染等[11]；母体本身疾病，如：生殖器官异常、HPV感染、CMV感染等；内分泌异常：严重的糖尿病未得到控制、黄体功能不足、甲状腺功能降低、多囊卵巢综合征；免疫功能异常等[12]均可能导致自然流产。Li等[13]通过使用qRT-PCR、免疫组化等方法发现肿瘤抑制基因程序性细胞死亡因子4(PDCD4)通过参与介导血清雌二醇和孕酮的表达水平以及相关细胞因子的表达，为治疗稽留流产提供了新的诊断和治疗策略。近年来对伤寒沙门氏菌等的探讨对未来稽留流产的诊疗策略提供了广泛的前景[14]。由于该种流产通常有相对较多的坏死组织、血凝块和其他杂质，大多数绒毛细胞已经机化和变性，可以培养出细胞分裂象的几率相对较小，染色体形态畸变不符合检测要求，导致检测失败。而间期FISH检测不需要细胞培养，因此不受组织污染的影响，具有样本量小、操作简便、检测快速、成功率高的优点。可以为发病原因探讨提供一定的理论依据，对于遗传咨询和指导下一次妊娠也具有积极意义[15]；但是，由于FISH只能检测出7对染色体(13、16、18、21、22、X和Y)的数量，尚不能检测染色体结构重排和变异，且该检测方法对温度、光照、湿度和各种试剂的PH值要求较高、费用相对昂贵，使其不能被大众普遍认可，也成为该方法临床应用的自身局限性。

表1 112例异常染色体类型和例数

综上所述，染色体异常可能是稽留流产发生的主要因素之一；间期FISH的检测方法对于稽留流产的病因诊断有一定的预测价值，但是是否值得临床普及推广还需要进一步探讨验证。