小花清风藤不同药用部位及溶剂提取物对四氯化碳致小鼠急性损伤的保护作用

李玉玲 李建桥 胡建忠 贺海波 邹 坤 李 蓉 殷丽强 汪鋆植

(1.三峡大学 生物与制药学院&天然产物研究与利用湖北省重点实验室, 湖北 宜昌 443002； 2.水利部水土保持植物开发管理中心, 北京 100053)

小花清风藤(Sabia.ParvifloraWall.ex Roxb)为清风藤科清风藤属藤本植物，主要分布于贵州、云南、广西等地[1-3]，其茎根入药治疗急性黄疸型肝炎，清热利湿并治疗风湿劳伤[4-5]．本实验用四氯化碳(CCl4)复制小鼠的肝损伤模型，观察小花清风藤不同药用部位及溶剂提取物对CCl4致小鼠急性损伤的保护作用，为今后进一步研究其保肝护肝作用及可能的作用机制奠定了基础．

1 材料与方法

1.1 试验药物

小花清风藤茎和叶采自贵州省黔西南布依族苗族自治州兴义市册亨县，植物标本现保存于该实验室(标本编号：201700227)．小花清风藤茎、叶及茎叶自然混合物用水、50%乙醇和95%乙醇超声提取后，浓缩干燥后，其茎经水、50%乙醇和95%乙醇超声提取和浓缩，干膏重量分别为20.0 g、11.23 g和20.0 g，1 g干膏相当于生药量分别为10、17.8和10 g生药；其叶经水、50%乙醇和95%乙醇超声提取和浓缩，干膏重量分别为36.02 g、45.64 g和12.00 g，1 g干膏相当于生药量分别为5.5、4.4和16.7 g生药；其茎和叶混合物经水、50%乙醇和95%乙醇超声提取和浓缩，干膏重量分别为24.72 g、20.14 g和15.00 g，1 g干膏相当于生药量分别为8.1、9.9和13.3 g生药．水飞蓟素胶囊(德国马博士大药厂，批号：150214，规格：140 mg/颗)．

1.2 实验动物

选择野生型KM小鼠168只，雄性，6～8周龄，体重18～20 g，购于三峡大学实验动物中心并饲养于SPF级动物室，许可证号：SCXK(鄂)2011-0012．

1.3 试剂

CCl4(分析纯)：成都市科龙化工试剂厂；欧丽微兰橄榄油：广州市粮油工业有限公司；谷丙转氨酶(ALT)试剂盒、谷草转氨酶(AST)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)：南京建成生物工程研究所；蛋白定量检测试剂盒：南京建成生物工程研究所；其他试剂均为分析纯．

1.4 仪器

电子分析天平：中国上海梅特勒-托利多有限公司；台式高速离心机：德国Eppendof公司；Tecan多功能酶标仪：瑞士TECAN集团公司．脱水机：德国Leica公司；超薄切片机：奥地利莱卡公司；摊片烤片机：孝感市宏业医用仪器有限公司；多功能显微镜及图像分析系统：德国Leica公司．

1.5 实验方法

1.5.1 CCl4橄榄油溶液的配置

用移液器分别取0.5 mL的CCl4加入橄榄油定容至50 mL，混合均匀，配置体积分数为0.5%的CCl4橄榄油溶液，于通风橱操作，现配现用．

1.5.2 实验分组及给药

取昆明雄性小鼠共168只，随机分为21组，每组8只，即正常组、CCl4模型组、水飞蓟素组(200 mg/kg)、水提取组(茎、叶、茎叶自然混合)低、高剂量组、50%乙醇提取组(茎、叶、茎叶自然混合)低、高剂量组、95%乙醇提取组(茎、叶、茎叶自然混合)低、高剂量组．正常组灌胃给予等体积的0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，其余组均按20 mL/kg灌胃给药，每日1次，连续7 d．于末次给药后2 h，除正常组实验小鼠腹腔注射橄榄油外，其余各组均按10 mL/kg的剂量腹腔注射0.5%的CCl4橄榄油溶液．实验期间自由饮水和进食．

1.5.3 实验小鼠行为及体征观察

每天观察实验小鼠的活动、进食、精神状态、毛发、排泄物及死亡情况．

1.5.4 肝脏质量的称量和指数的计算

实验小鼠眼眶取血完毕后，取肝脏进行称量，计算其质量指数．

1.5.5 肝组织中ALT和AST活性测定

取肝脏组织用生理盐水进行组织匀浆后，用离心机离心15 min后，收集上清液，用多功能酶标仪检测肝组织中ALT和AST含量．具体方法按照试剂盒中说明书进行．

1.5.6 肝组织中SOD、GSH-Px活性和MDA含量的测定

取肝脏匀浆上清液测肝组织中SOD、GSH-Px活性和MDA含量．具体方法按照试剂盒中说明书进行．

1.5.7 肝组织病理形态学分析

取血完毕后，取小鼠肝组织，经4%多聚甲醛溶液固定，不同乙醇梯度脱水，常规石蜡进行切片包埋，经HE染色后，在光镜下观察结肝组织病理学变化．

1.6 数据统计分析

2 结 果

1)小花清风藤不同药用部位及溶剂提取物对CCl4致小鼠行为和体征的影响如下：

在CCl4致急性肝损伤的小鼠模型制作过程中，正常组小鼠皮毛紧密、有光泽，活泼，饮食及二便均正常；模型小鼠给予CCl4后出现被毛松散，懒动；小花清风藤的茎、叶及茎叶自然混合物用水(茎水提物：SJ，叶水提物：SY，茎叶自然混合物水提物：SJY)、50%乙醇(茎50%乙醇提物：50%AJ，叶50%乙醇提物：50%AY，茎叶自然混合物50%乙醇提物：50%AJY)和95%乙醇(茎95%乙醇提物：95%AJ，叶95%乙醇提物：95%AY，茎叶自然混合物95%乙醇提物：95%AJY)提取物治疗后，均有不同程度的改善．在小花清风藤不同药用部位及溶剂提取物中，以SJY作用效果最好，95%AJY和50%AY效果次之．

2)小花清风藤不同药用部位及溶剂提取物对CCl4致小鼠急性肝损伤模型肝质量及质量指数的影响，见表1～3．

表1 水提取物对CCl4致小鼠急性肝损伤模型肝质量及质量指数的影响

与正常组比较，#P<0.05,##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01

表2 50%乙醇提取物对CCl4致小鼠急性肝损伤模型肝质量及质量指数的影响

与正常组比较，#P<0.05,##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01

表3 95%乙醇提取物对CCl4致小鼠急性肝损伤模型肝质量及质量指数的影响

续表3

与正常组比较，#P<0.05,##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01

由表1～3可见，模型组小鼠的肝质量及肝质量指数明显增加，与正常组比较具有显著性差异(P<0.01)；用小花清风藤的茎、叶及茎叶自然混合物的水、50%乙醇和95%乙醇提取物治疗后，均有不同程度的降低．在小花清风藤不同药用部位及溶剂提取物中，以SJY、SJ和50%AJY作用效果最为显著，与模型组比较，差异有显著和非常显著性意义(P<0.05或P<0.01)．

3)小花清风藤不同药用部位及溶剂提取物对CCl4致小鼠急性肝损伤模型肝组织中转氨酶活性的影响，见表4～6．

表4 水提取物对ALT、AST活性的影响

与正常组比较，#P<0.05,##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01

表5 50%乙醇提取物对ALT、AST活性的影响

与正常组比较，#P<0.05,##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01

表6 95%乙醇提取物对ALT、AST活性的影响

与正常组比较，#P<0.05,##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01

由表4～6可见，模型组小鼠肝组织中ALT和AST活性显著升高，以ALT升高较为明显，与正常组比较具有显著性差异(P<0.01)；用小花清风藤的茎、叶及茎叶自然混合物的水、50%乙醇和95%乙醇提取物治疗后，ALT和AST活性均有不同程度的降低，尤其是ALT改善效果最为明显．在小花清风藤不同药用部位及溶剂提取物中，以SJY、95%AJY和50%AJY作用效果最为显著，与模型组比较，差异有显著和非常显著性意义(P<0.05或P<0.01)．

4)小花清风藤不同药用部位及溶剂提取物对CCl4致小鼠急性肝损伤模型肝组织形态学的影响，如图1～3所示．

A：正常组；B：模型组；C：水飞蓟素组；D：SJ-L组；E：SJ-H组；F：SY-L组；G：SY-H组；H：SJY-L组；I：SJY-H组图1 水提取物对CCl4致小鼠急性肝损伤模型肝组织病理学的影响

镜下组织学观察：正常组小鼠肝组织结构正常，肝小叶结构较为清楚，以中央静脉为中心的肝细胞呈放射状排列，肝索排列规则有序，肝窦、汇管区成纤维细胞少．模型组小鼠肝组织可见脂肪变性，肝细胞肿

A：正常组；B：模型组；C：水飞蓟素组；J：50%AJ-L组；K：50%AJ-H组；L：50%AY-L组；M：50%AY-H组；N：50%AJY-L组；O：50%AJY-H组图2 50%乙醇提取物对CCl4致小鼠急性肝损伤模型肝组织病理学的影响

A：正常组；B：模型组；C：水飞蓟素组；P：95%AJ-L组；Q：95%AJ-H组；R：95%AY-L组；S：95%A Y-H组；T：95%AJY-L组；U：95%AJY-H组图3 95%乙醇提取物对CCl4致小鼠急性肝损伤模型肝组织病理学的影响

胀，间界限不清，呈现弥漫性小泡性脂变，胞质中可见脂肪滴，细胞核位于细胞质边缘；肝小叶和汇管区可见炎症细胞浸润，肝窦、汇管区成纤维细胞增多，与正常组比较有显著性差异(P<0.01)；SY、50%AY和95%AY组肝内虽可见片状坏死或点状坏死，但坏死程度和模型组相比无明显差异(P>0.05)；50%AJ和95%AJ组肝内偶见点状坏死，坏死程度比模型组明显减轻，与模型组比较有显著性差异(P<0.05)；SJY、SY、50%AJY和95%AJY组肝细胞损伤和坏死程度显著减轻，与模型组比较有显著性差异(P<0.01)．

5)小花清风藤茎叶药用部位不同溶剂提取物对CCl4致小鼠急性肝损伤模型肝组织中SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影响，见表7．

表7 不同溶剂提取物对CCl4致小鼠急性肝损伤模型肝组织中SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影响

与正常组比较，#P<0.05,##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01

由表7可见，模型组中SOD和GSH-Px活性明显下降，MDA含量明显升高，以SOD上升较为明显，与正常组比较具有显著性差异(P<0.01)；用SJY、50%AJY和95%AJY治疗后，SOD和GSH-Px活性均有不同程度的升高，MDA含量有不同程度降低，尤其是对MDA的改善效果最为明显．在小花清风藤不同药用部位及溶剂提取物中，以SJY的作用效果最为显著，与模型组比较，差异有显著和非常显著性意义(P<0.05或P<0.01)．

3 讨 论

CCl4等多种毒性物质所引起的肝损伤以及病毒性肝炎的病理学机制与自由基的生成造成脂质过氧化有关，故自由基清除剂有可能拮抗其肝毒性[6-7]．

已有研究表明，小花清风藤对病毒性肝炎和急性肝损伤具有较好的疗效，但是何种有效组分(成分)发挥疗效，目前尚未完全弄清楚．在实验中发现小鼠经CCl4损伤后，小鼠肝组织中ALT和AST均明显升高；用小花清风藤的茎、叶及茎叶混合物的水、50%乙醇和95%乙醇提取物治疗后，ALT和AST活性均有不同程度的降低，尤其是ALT改善效果最为明显．在小花清风藤不同药用部位及溶剂提取物中，以SJY、95%AJY和50%AJY作用效果最为显著．实验提示小花清风藤具有一定的保护肝脏活性并且茎叶混合物部位作用较强，呈现出较好的量效关系．病理形态学观察到模型组肝小叶结构不完整，肝细胞结构损伤较严重，小花清风藤茎叶水提取部位组对小鼠的肝损伤有明显减轻，肝细胞结构趋于完整，气球样肝细胞难以见到，炎性细胞浸润很少，显示其有明显的抗肝损伤作用．

ROS可被生物体内SOD清除，从而减轻其对细胞造成的损伤．谷胱甘肽是细胞内含量最丰富的非蛋白巯基，在体内主要以GSH和GSSG存在，肝脏是其体内合成的主要场所[8-11]．研究结果显示，经CCl4处理后，模型组小鼠肝组织中SOD和GSH-Px活性降低显著，而MDA含量明显升高；用小花清风藤的茎叶混合物的水、50%乙醇和95%乙醇提取物治疗后，SOD和GSH-Px活性均有不同程度的升高，MDA有不同程度降低，尤其是MDA的改善效果最为明显．在小花清风藤不同药用部位及溶剂提取物中，以SJY的作用效果最为显著．上述实验结果与肝组织形态学结果相一致．

综上所述，小花清风藤对CCl4致小鼠急性肝损伤具有显著的保护作用，可减轻CCl4对肝脏的脂质过氧化损伤，降低肝组织中ALT和AST活性，升高肝组织中SOD和GSH-Px含量，降低肝组织中MDA含量，从而减轻CCl4对肝组织氧化应激损伤，改善肝脏病理组织学形态，保护肝细胞从而恢复肝功能，并验证其作用机制与其抗氧化作用有关．在小花清风藤水提取组低、高剂量组、50%乙醇提取组低、高剂量组、95%乙醇提取组中，以SJY作用效果比较好，依次是50%AJY、95%AJY、SJ、50%AJ、95%AJ、SY、50%AY、95%AY，且呈现明显的量效关系．