板芪口服液定性与定量方法的研究

董蒨蒨，孙耀贵，孙 娜，尹 伟，范阔海，李宏全

(山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801)

板芪口服液是由黄芩、黄芪、丹参、连翘等药材提取的中药复方制剂，具有扶正祛邪，补气升阳，清热解毒，消肿散结的功效。临床上主要治疗猪病毒性心肌炎引起的发热、精神沉郁、减食或停食，蹄部皮肤开裂出血、蹄壳变形或脱落[1-2]等问题。目前中药制剂作为药物或饲料添加剂治疗动物疾病具有毒副作用小、不易产生耐药性和绿色安全等优点[3]。所以，建立完善的中药质量标准有利于形成自主创新的新兽药研究开发体系，更利于中兽药产业的迅速发展。为了有效控制中兽药质量标准，研究参考相关文献与实验室已有的质量控制方法，建立了定性鉴别黄芪、丹参、黄芩、连翘的薄层色谱方法与定量测定有效成分黄芩苷的HPLC法。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 Agilent1260高效液相色谱仪(Agilent公司)；薄层色谱仪(CAMAG公司)；电子分析天平(赛多利斯公司)；SB25-12D超声清洗机(Scientz公司)。

1.2 试药 黄芩苷对照品(批号110715-201720)、黄芩素(批号111595-200905)、黄芩对照药材(批号120955-201309)、黄芪甲苷对照品(批号110781-201515)、黄芪对照药材(批号120974-201311)、连翘苷对照品(批号110821-201615)、连翘对照药材(批号120908-201216)、丹参酮ⅡA(批号110766-200619)、丹参对照药材(批号120923-201625)购自中国食品药品检定研究院。甲醇为色谱纯(Merck公司)，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。板芪口服液由黄芪、黄芩、丹参、连翘、板蓝根、蒲公英药材分二次煎煮，合并煎煮液滤过，浓缩至要求密度后醇沉滤过、回收乙醇，配液、灌封。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 黄芪TLC鉴别 取本品10 mL，水饱和的正丁醇溶液振摇提取2次，每次10 mL，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次10 mL，再用正丁醇饱和的水溶液洗涤2次，每次10 mL，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。按处方比例，取除黄芪外的其他药材，同法制成阴性对照溶液。1 g黄芪对照药材加甲醇20 mL，超声30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水10 mL溶解，同法制备作为黄芪对照药材溶液。对照品：1 mg/mL黄芪甲苷溶液。吸取上述对照品、对照药材溶液各5 μL，供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL点于同一G板上，以氯仿∶甲醇∶水(13∶7∶2)10 ℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，分别置紫外灯(365 nm)和日光下检视。结果如图1-A(365 nm)、1-B(日光)，供试品在与对照品、对照药材色谱相应的位置上显相同的橙红色斑点(365 nm)、红色斑点(日光)，缺黄芪阴性对照在相同斑点处未见干扰。

2.1.2 连翘TLC鉴别 取本品10 mL加氯仿提取两次，每次10 mL，合并氯仿，蒸干，加1 mL甲醇溶解，作为供试品溶液。按处方比例, 取除连翘外的其他药材, 同法制成阴性对照溶液。1 g连翘对照药材加水50 mL，超声30 min，过滤，滤液同法制备作为连翘对照药材溶液[4]。对照品：0.25 mg/mL连翘苷对照品溶液。吸取上述溶液各10 μL点于同一G板上，以氯仿∶甲醇(8∶1)为展开剂，展开，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置于日光下检视。结果如图2，供试品在与对照品、对照药材色谱相应的位置上显相同的褐色斑点，缺连翘阴性对照在相同斑点处未见干扰。

1:对照品(control);2:对照药材(control medicinal material);3-5:三批板芪口服液样品(Three batches of Banqi oral liquid samples);6:阴性对照(negative control)图1 黄芪薄层色谱图方法验证Fig 1 Verification of the method of TLC of Astragali radix

1:对照品(control);2:对照药材(control medicinal material);3-5:三批板芪口服液样品(Three batches of Banqi oral liquid samples);6:阴性对照(negative control)图2 连翘薄层色谱图方法验证Fig 2 Verification of the method of TLC of forsythia suspensa

2.1.3 黄芩TLC鉴别 取本品10 mL加乙酸乙酯提取三次，每次10 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，加1 mL甲醇溶解，作为供试品溶液。按处方比例, 取除黄芩外的其他药材, 同法制成阴性对照溶液。1 g黄芩对照药材加乙酸乙酯∶甲醇(3∶1)30 mL超声30 min，过滤，滤液蒸干，残渣加甲醇5 mL溶解作为黄芩对照药材溶液。对照品：1 mg/mL黄芩素对照品溶液。吸取上述对照品、对照药材溶液各5 μL，供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL点于同一默克板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲醇∶甲酸(10∶3∶1∶2)为展开剂，预饱和30 min，展开，晾干，置于日光下检视。如图3结果显示供试品在与对照品、对照药材色谱相应的位置上显相同的黄色斑点，缺黄芩阴性对照在相同斑点处未见干扰。

1:对照品(control);2:对照药材(control medicinal material);3-5:三批板芪口服液样品(Three batches of Banqi oral liquid samples);6:阴性对照(negative control)图3 黄芩薄层色谱图方法验证Fig 3 Verification of the method of TLC of Scutellariae radix

2.1.4 丹参TLC鉴别 取本品10mL用水饱和的正丁醇溶液振摇提取2次，每次10 mL，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次10 mL，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。按处方比例,取除丹参外的其他药材,同法制成阴性对照溶液。1 g丹参对照药材加入5 mL乙醇，超声15 min，离心10 min，取上清作为对照药材溶液。对照品：0.5 mg/mL丹参酮ⅡA对照品溶液。吸取上述对照品、对照药材溶液5 μL，供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL点于同一默克板上，用氯仿∶甲苯∶乙酸乙酯∶甲醇∶甲酸(6∶4∶8∶1∶4)作为展开剂展开，晾干，在365 nm下检视。结果如图4，供试品在与对照品、对照药材色谱相应的位置上显相同的蓝色斑点，缺丹参阴性对照在相同斑点处未见干扰。

1:对照品(control); 2:对照药材(control medicinal material);3-5:三批板芪口服液样品(Three batches of Banqi oral liquid samples);6:阴性对照(negative control)图4 丹参薄层色谱图方法验证Fig 4 Verification of the method of TLC of Salvia miltiorrhiza

2.2 黄芩苷的含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：甲醇∶水∶磷酸(47∶53∶0.2)，流速：1 mL/min，检测波长：280 nm，柱温：25 ℃，进样量：10 μL，以黄芩苷计理论塔板数不低于2500。

2.2.2 样品溶液的制备 对照品制备：精密称定黄芩苷对照品12.25 mg，加甲醇稀释制成61.25 μg/mL的对照品溶液。

供试品制备：精密量取板芪口服液5 mL于100 mL容量瓶中，加70%乙醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液1 mL加甲醇至10 mL，即得。

阴性对照制备：除黄芩药材外其余按处方比例根据板芪口服液工艺制得的样品，按供试品制备方法制备，即得。

2.2.3 系统适应性实验 取上述溶液各10 μL进样，记录HPLC色谱图，如图5，黄芩苷对照品出峰时间为12.5分左右，供试品溶液在相同时段目标峰与其他峰分离度均大于1.5，基线平稳；缺黄芩的阴性溶液在12.5分左右基线平稳，无干扰峰出现，表明黄芩苷的测定方法适用于板芪口服液的含量测定。

图5 黄芩苷对照品(A)、样品(B)、阴性对照(C)HPLC色谱图Fig 5 HPLC chromatogram of Baicalin control (A), sample (B) and negative control (C)

2.2.4 线性范围考察 取黄芩苷对照品溶液(382.8 μg/mL)加甲醇稀释至不同浓度进行进样，得回归方程y=3021.3x-31.634，R2=0.9999，结果表明黄芩苷标准品的进样量在0.1531～1.225 L之间线性关系良好。

2.2.5 精密度试验 黄芩苷对照品溶液重复进样6次，记录峰面积，结果可得黄芩苷峰面积的RSD值为0.12%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 重复性试验 制备6份供试品溶液进行进样，记录峰面积，结果样品中黄芩苷的含量为2.736 mg/g，RSD值为1.88%，表明实验方法的重复性好。

2.2.7 稳定性实验 取一份供试品溶液，在0、2、4、8、12、24 h进样，记录峰面积，结果6次测定的RSD值为0.86%，表明样品在24 h内有良好的稳定性。

2.2.8 加样回收率 精密称取已知含量1.370 mg/mL的样品18份, 每份1 mL置于25 mL容量瓶中, 精密加入低中高浓度(分别为0.451、0.975、1.421 mg/mL)的黄芩苷对照品溶液1 mL，按板芪口服液供试品制备, 进样10 μL, 测定峰面积，计算加样回收率。结果得加样回收率分别为96.99%、98.06%、98.96%，RSD值分别为2.02%、1.81%、1.29%。

2.2.9 含量测定 取三批板芪口服液，按上述方法测得黄芩苷的平均含量为2.71 mg/mL，RSD值为2.94%。

3 讨论与结论

通过对黄芪、连翘、黄芩和丹参的TLC鉴别作为板芪口服液的定性鉴别。其中黄芪的TLC鉴别方法参考了本实验室前期黄芪鉴别的方法，结果发现用正丁醇饱和水溶液洗涤后的条带更加清晰，杂质更少，所以选择此方法。连翘的TLC鉴别中，在365 nm下颜色较暗，不易观察。日光下斑点颜色明亮，易于观察。所以选择在日光下检视。

黄芩的TLC鉴别中，参照文献采用了不同提取溶剂包括水饱和正丁醇、氯仿、乙酸乙酯等，以及不同的展开条件进行试验。其中水饱和正丁醇作为提取溶剂效果最好。在使用GF254板与聚酰胺薄膜[5]，展开剂为甲苯∶丙酮∶冰醋酸∶甲酸(8∶1∶1∶1)[6]的试验中，由于对应斑点不圆整未采用。参照《中国兽药典》[7]中双黄连口服液的质量标准使用聚酰胺薄膜。两种展开剂分别为甲苯∶乙酸乙酯∶甲醇∶甲酸(10∶3∶1∶2)[8]与乙酸[9]，结果显示斑点的分离度均不好，未采用。参照陆静娴等人的研究，使用青岛海洋G板，两种展开方法分别为氯仿∶甲醇(9∶1)晾干后喷以2%三氯化铁乙醇溶液[10]和乙酸乙酯∶丙酮∶甲酸∶水(5∶3∶1∶1)[11]，结果由于对照品的斑点不清晰未采用。最后使用默克板得到清晰完整的斑点，所以选择此方法。之前选择的对照品为黄芩苷，但由于在所有方法中黄芩苷的斑点的RF值小于0.2，所以采用黄芩素作为对照品。

丹参的TLC鉴别中，采用不同方法处理样品，其中用水饱和的正丁醇溶液提取、氨试剂洗涤效果最好。在两种展开剂氯仿∶甲苯∶乙酸乙酯∶甲醇∶甲酸(6∶4∶8∶1∶4)与先用此展开剂展至4 cm再用石油醚(60-90)∶乙酸乙酯(4∶1)展至8 cm下采用青岛海洋G板、GF254板[12]，默克板进行展片，结果显示默克薄层板在前者展开剂的斑点最圆整且分离度好，所以采用此方法。另外还参照文献采用了聚酰胺薄膜，展开剂为丙酮∶36%乙酸∶氨水(10∶25∶1)，晾干后用氨熏蒸5 min[13]，此方法条带清晰，但斑点不清晰，所以没有采用。

板芪口服液的含量测定最初选择黄芪甲苷、连翘苷、丹酚酸B与黄芩苷为指标成分，但由于试验中还涉及了板芪口服液的工艺研究，前三种指标成分含量过低，误差大，而黄芩苷的含量高，更具有统计学意义，所以选择黄芩苷为含量测定的指标成分。黄芩苷的含量测定参照《中国兽药典》中黄芩药材的含量测定方法，样品与黄芩苷对照品对应的峰分离度好，基线平稳，可作为含量测定的定性方法。

板芪口服液的薄层色谱鉴定方法与高效液相色谱含量测定方法的研究为板芪口服液的质量标准奠定了基础，为后期新兽药的申报提供了数据支持。