双层HEPA采用过氧化氢消毒方式的消毒效果研究

陈 思，王 栋，孙庆印，张晓宇，杜春晓，汤国庆，周 琦

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，哈尔滨 150069）

0 引言

随着进出口贸易规模的日益扩大及城市化、工业化进程的加快，各种不确定因素引发的高致病性人畜共患传染病全球频发。为防范生物入侵、防止生物污染、维护国门生物安全，我国自20世纪80年代起建设高等级生物安全实验室，截至目前已建成并正式投入运行的最高级别生物安全实验室共2家，其中国家动物疫病防控高级别生物安全实验室是我国首个自主设计及建设、不受任何国外势力控制和影响、亚洲规模最大的大动物最高级别生物安全实验室，仅高效空气过滤器（high efficiency particulate air filter，HEPA）就配备 110余套，过滤器总计 267余个[1]。

针对实验室最重要的关键防护屏障——HEPA，我国颁布的GB 19489—2008《实验室生物安全通用要求》中第6.4.16条[2]和中国合格评定国家认可委员会（China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CNAS）制定的 CNAS-CL53：2016《实验室生物安全认可准则对关键防护设备评价的应用说明》中第5.7.3条[3]均指出在安装和更换HEPA前，必须进行彻底消毒，并对消毒效果进行评价。

我国在空间消毒灭菌技术方面应用最多的方式有甲醛熏蒸、臭氧、过氧化氢蒸汽灭菌等。其中，甲醛熏蒸具有剧毒、易燃、强腐蚀性、蒸汽引起呼吸道及眼睛等部位强烈不适等不足，臭氧具有对人体呼吸道黏膜有刺激性、强氧化性等缺点，且这2种方式很难杀灭6-log嗜热脂肪芽孢杆菌。而过氧化氢蒸汽灭菌消毒后无有害物质残留，且灭菌效果能完全杀灭6-log嗜热脂肪芽孢杆菌。因此，近年来大多数生物安全实验室采取安全、有效、环保的过氧化氢蒸汽消毒方式[4-5]。动物生物安全三级实验室（ABSL-3实验室）的HEPA为单层过滤，动物生物安全最高级别实验室（ABSL-4实验室）的HEPA为双层过滤。既往文献[6-8]中多为过氧化氢消毒装置对物体表面消毒效果的研究，或ABSL-3实验室中HEPA的原位消毒措施和ABSL-4实验室中HEPA原位消毒的研制[9]，在实际操作时缺乏各项指标作参考。因此，笔者通过大量实验，探讨合适的消毒机器、最低剂量等，为我国生物安全领域的工作人员在消毒机的选择及剂量控制等方面提供建议和指导。

1 材料与方法

本次消毒采用国外A品牌[过氧化氢蒸汽（hydrogen peroxide vapour，HPV）消毒方式]和 B 品牌[汽化过氧化氢（vaporized hydrogen peroxide，VHP）消毒方式]过氧化氢消毒机，同时对相同体积的2套双层HEPA单元进行消毒效果的验证及评估。

1.1 实验材料

消毒剂：35%的过氧化氢消毒液（厂商Bioquell，型号HPV-AQ，批号CFE5000064201705）。中和剂溶液：10 g/L硫代硫酸钠磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）。培养基：胰蛋白胨大豆肉汤培养基，121℃高压灭菌15 min。消毒机：国外A品牌和B品牌过氧化氢消毒机，相关参数详见表1。

表1 两品牌消毒机参数对照表

1.2 消毒对象

消毒对象为国家动物疫病防控高级别生物安全实验室设备层的2台体积约为5 m3的箱式排风HEPA，过滤单元为双层过滤。HEPA购自美国康菲尔公司，对0.3 μm气溶胶粒子的过滤效率为99.99%。箱体进风口和出风口均设有电动气密阀，气密阀前端均配有消毒管道接口，可实现原位消毒。

1.3 消毒环境

消毒机检测过滤单元内部的环境温度26℃，相对湿度10.5%。

1.4 杀菌效果鉴定

用生物指示剂Steris嗜热脂肪芽孢杆菌（ATCC 12980）不锈钢菌片（厂商 Steris，批号 H0668）、化学指示剂Steris PCC051（Steris）。灭菌后的菌片在培养基内培养（温度57℃）7 d。若7 d后培养基澄清，则灭菌合格；反之，则灭菌失败。化学指示卡灭菌后，观察端部变色块的颜色变化，若彻底变成黄色则消毒成功，否则消毒失败。化学指示卡对灭菌时间和温度要求较低，不能集中显示灭菌情况，但可以作为生物监测的先导，起参考作用。

1.5 实验方法

1.5.1 准备阶段

为验证消毒效果，取出HEPA按图1所示位置放置6组生物指示剂和化学指示卡，放置位置均位于不易彻底灭菌的死角，待指示剂粘贴完成后将HEPA装回。A品牌的实际操作现场如图2所示，B品牌的实际操作现场如图3所示。

图1 生物指示剂和化学指示卡分布位置图

图2 A品牌消毒机消毒现场

图3 B品牌消毒机消毒现场

1.5.2 消毒阶段

确认空调处于关闭状态，关闭电动气密阀，使高效过滤单元处于密闭状态，开启消毒口处蝶阀，同时启动A、B品牌过氧化氢消毒机。

（1）A品牌消毒机。

该消毒机的消毒过程分为准备（时间至少10 min）、注入、保持和分解通风4个阶段。准备阶段为消毒机自检阶段；注入阶段为过氧化氢的高速注入阶段，使过氧化氢蒸汽体积分数迅速升高；保持阶段为高体积分数过氧化氢蒸汽保持一定时间，期间有过氧化氢低速注入。工作人员通过调节A品牌消毒机注入和保持阶段消毒液的注入速率、注入时间来完成不同条件下的灭菌效果（其他阶段的参数使用消毒机自动默认参数，不需要修改）。对A品牌消毒机进行3组实验，实验中各阶段过氧化氢不同注入速率、持续时间及消毒液用量参数详见表2。双层HEPA结构特殊，因此将注入、保持阶段的持续时间均设为60 min，保持阶段注入速率设置为1 g/min，保持过氧化氢蒸汽体积分数不急速衰减。通过调节注入阶段的注入速率，观察双层HEPA尾端过氧化氢蒸汽体积分数的变化。过氧化氢蒸汽体积分数是消毒效果的侧面判断依据。3组实验中各阶段过氧化氢蒸汽最高体积分数详见表3。在消毒剂注入总量超过360 ml时，尾端过氧化氢蒸汽最高体积分数几乎不变，从而证明整体的消毒效果已达到极值。

表2 3组实验中各阶段过氧化氢不同注入速率、持续时间及消毒液用量

表3 3组实验中各阶段过氧化氢蒸汽最高体积分数ppm

（2）B品牌消毒机。

该消毒机的消毒过程分为准备（2 min）、注入和通风3个阶段。本次消毒设置为智能调节程序，由于实验室环境相对湿度约为10.5%，即VHP灭菌起始相对湿度为10.5%，在此条件下，将饱和度上限设为30%、下限设为25%时，才能保证汽化过氧化氢体积分数足够高，且不产生冷凝水（冷凝水会严重影响高效过滤芯的通透性和过氧化氢的消毒效果）。风机以400 m3/h的流速工作，在此流速下汽化过氧化氢有较好的穿透效果。注入阶段持续时间3 h，由于箱式排风高效过滤器的体积仅为5m3，因此注入速率应尽量小。该消毒机的注入速率为5～45 g/min，本实验中选择6 g/min的注入速率，持续注入消毒液309 ml。智能调节程序下重复消毒3次，查看每次消毒结果。由于B品牌消毒机体积分数检测口与蒸汽注入口位置较近且无分隔，而汽化过氧化氢体积分数值 10 min 后已达到 300 ppm（1 ppm=1×10-6）以上，说明体积分数检测错误，故无法给出各个阶段体积分数变化情况，仅能通过菌片培养来检测消毒效果。

2 消毒效果评价

B品牌消毒机为自动控制程序，可根据环境情况自动调节。为对比A、B品牌消毒机的消毒效果，应尽量将A品牌的参数设置与B品牌参数对应。A品牌消毒机消毒过程在注入、保持阶段注入速率由1 g/min调至5 g/min，3组实验的分解通气阶段过氧化氢蒸汽体积分数变化趋势如图4所示，各组实验在分解通风阶段的最高体积分数为130、170和170 ppm。

图4 A品牌3组实验分解通气阶段过氧化氢蒸汽体积分数变化趋势

消毒结束后，收集各点生物指示剂和化学指示卡。在生物安全柜内，取10 g/L硫代硫酸钠PBS 0.5 ml和胰蛋白胨大豆肉汤培养液4.5 ml放入试管内，把生物指示剂内的不锈钢菌片取出，放入试管内。实验设置1组阳性对照组、1组阴性对照组。将试管放入恒温培养箱（57℃）培养7 d[生物指示剂Steris嗜热脂肪杆菌（ATCC12980）的培养温度为57℃]。A、B品牌消毒机消毒效果如图5、6所示。

图5 A品牌消毒机消毒效果

图6 B品牌消毒机消毒效果

实验证明，A品牌消毒机消毒完成后，其进气口端、中间端的化学指示卡完全由红褐色变成黄色，视为合格；尾端边缘仍存在褐色痕迹，视为不合格。生物指示剂实验结果表明，阳性对照组培养基浑浊，表示有菌生长；阴性对照组澄清透明，视为无菌生长；实验组培养基进气口端、中间端保持澄清，视为完全灭菌，尾端浑浊，视为未完全灭菌。

B品牌消毒机消毒完成后，各点化学指示卡由红褐色完全变为黄色，视为合格。生物指示剂实验结果表明，阳性对照组培养基浑浊，表示有菌生长；阴性对照组澄清透明，视为无菌生长；实验组培养基保持澄清透明，视为完全灭菌。

3 讨论

本实验中过滤器风阻压力为250 Pa，允许通过的最大风量为4 080 m3/h。因汽化过氧化氢穿透性差，ABSL-4实验室的双层过滤器难以渗透，故采取风机速率至少为200 m3/h的过氧化氢消毒机。国内常用的过氧化氢消毒机均针对实验室消毒，没有专门针对HEPA设计消毒机。根据实际应用状况，笔者针对本文讨论的消毒机给出以下建议：

（1）A品牌消毒机的风机速率小，不能完全渗透第2层过滤器，其尾端（出气口端）不符合消毒效果要求。建议厂家改进消毒机内风机，提高风量。

（2）B品牌消毒机具备风机风量大和智能控制2个优点，其主动循环功能使汽化过氧化氢穿透HEPA速率加快。相比A品牌消毒过程，B品牌消毒机用时短，且通过实验证明消毒效果达到要求。但在连接HEPA方面，仍存在泄漏的风险。建议B品牌消毒机改进回流和气密性设计，达到安全、高效灭菌。

（3）对于使用方：建议在购买前注意消毒机的各项参数，尤其是风速、风量等关键参数；另外，应选择“层层过滤”的方式对HEPA进行消毒过滤。将2层HEPA中间的检样口作为消毒口，从根本上解决消毒不彻底、双层难穿越的问题，但需注意进、出口流量与消毒机的要求相同。

4 结语

生物安全是国家安全的重要组成部分，而高等级生物安全实验室又是生物安全领域的国之重器。HEPA作为生物安全实验室必不可少的关键防护设备，对其进行消毒十分关键。国内外的过氧化氢消毒机对双层HEPA的消毒效果有限，但根据其自身特点以及技术的推陈出新，国内必将出现更多适用的消毒设备。本文通过分析双层HEPA采用过氧化氢消毒方式的消毒效果，提出了3点建议。同时，希望同行业工作者给出更专业的消毒方式方法，提高我国生物安全的防护水平。