跑台运动通过激活AMPK减少APP/PS1小鼠海马Aβ沉积

闫清伟，赵 娜，夏 杰，李百侠，崔海燕

单磷酸腺苷活化蛋白激酶（adenosine 5'-monophosphateactivated protein kinase，AMPK）是能量代谢的开关，对维持机体能量代谢稳态有重要调节作用。研究证实，大脑能量代谢减退与阿尔茨海默症（Alzheimer's disease，AD）病理进程密切相关，能源物质ATP可抑制β-淀粉样蛋白（beta-Amyloid，Aβ）的高分子聚集，减弱其神经毒性，降低脑内老年性斑块（Senile plaques，SPs）的形成，继而发挥抗AD效应；而ATP合成不足，则可加速AD病理（Coskuner et al.，2014；Jung et al.，2012；Muller et al.，2017）。β-位淀粉样前体蛋白裂解酶1（beta-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1，BACE1）是Aβ生成的一种关键裂解酶，另外，能量代谢相关因子，如AMPK、去乙酰化酶1（Sirtuin1，Sirt1）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferatoractivated receptor gamma，PPARγ）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1 alpha，PGC1α）等可调节BACE1表达。有研究认为，AMPK-BACE1（即AMPK-Sirt1-PPARγ-PGC1α-BACE1）通路可调节Aβ生成，大脑能量代谢减退可通过下调AMPK活性及后续相关因子表达，产生级联反应，最终上调BACE1的脑内表达（Wang et al.，2013），继而增加脑内Aβ沉积，这可能是大脑能量代谢减退造成脑内SPs增多、认知功能减退的重要病理机制。

合理的运动对AD病理有积极的改善作用。2013年9月，华盛顿召开了国际大脑与营养学会议，会议上有学者指出，保持运动和健康生活方式是防治AD发病的有效措施（Barnard et al.，2014）。另有研究通过对MEDLINE，CINAHL，Web of Science，and Scopus等数据库文献研究发现，运动可提高AD患者的持续注意力、视觉记忆及前额叶认知功能（Hernandez et al.，2015）。对人体进行的实验研究也证实，3个月的有氧运动可以改善轻度AD患者的认知功能（Yang et al.，2015）。近年来有动物实验研究证实，运动可抑制Aβ生成，改善AD认知功能（余锋 等，2016；Koo et al.，2017；Moore et al.，2016；Zhang et al.，2017）。然而，关于运动改善AD病理，抑制Aβ沉积的分子机制，目前仍未探明。体育科学领域的研究证实，适当的运动可提高骨骼肌AMPK活性，上调Sirt1蛋白表达，影响AMPK/PGC1α信号（许杰 等，2018；Hoffman et al.，2015；Liao et al.，2017；Niederberger et al.，2015），但关于运动是否可提高脑内AMPK活性，影响AMPK-BACE1通路信号，继而影响Aβ生成与沉积的系统研究，目前鲜见报道。

APP/PS1小鼠是AD研究领域中一种经典的转基因动物模型，该模型小鼠体内被转入人类突变的APPSwe和PS1（PSEN1dE9）2个AD致病基因，导致APP/PS1小鼠自3月龄开始，脑内Aβ沉积逐渐增多，至5～6月龄时，脑内Aβ沉积更加显著，此时可检测出明显SPs，同时小鼠学习记忆能力显著下降（Collins et al.，2015；Guo et al.，2015；Mei et al.，2016；Sorrentino et al.，2017）。为探讨运动降低Aβ的分子机制，本研究采用APP/PS1小鼠为研究对象，对小鼠海马AMPK-BACE1通路及其相关因素进行系统检测与研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

本实验所用APP/PS1转基因小鼠和同窝野生型（wide type，WT）小鼠均购自南京模式动物中心，生产许可证号：SCXK（2015-0001），饲养环境温度：23℃～26℃，湿度50%～65%，12 h光照/12 h黑暗，SPF级转基因动物标准饲料，所有小鼠均自由饮食。

将3月龄APP/PS1小鼠48只及WT小鼠48只分别随机分组，即APP/PS1型小鼠分为APP/PS1安静对照组（ADC组，n=24）和APP/PS1运动组（ADE组，n=24），WT小鼠分为野生安静对照组（WTC组，n=24）和野生运动组（WTE组，n=24）。

1.2 运动方案

自3月龄开始，对ADE组、WTE组小鼠进行12周跑台运动。运动方案参考Baker等（1999）的研究，并做适当调整。本实验采用45%～55%最大摄氧量（45%～55%O2max）的中等强度有氧运动，通过文献分析及适应性训练发现，该运动方案在各组小鼠的可承受范围内，各组小鼠均能完成本运动训练。具体方案由1周运动适应和12周正式运动组成。

1周运动适应：第1～2天速度5 m/min，第3～4天速度8 m/min，第5～6天速度12 m/min。第1天运动时间20 min，之后每天延长5 min，至第6天运动时间延长至45 min。每天运动时间固定在18：00-20：00。周日休息。

12周正式运动：适应性运动1周后进行12周正式运动，每周一、二、三、五、六的18：00-20：00运动，周四、六休息。每天运动方案：5 m/min×5 min，8 m/min×5 min，12 m/min×30 min，最后以5 m/min×5 min后结束，总运动时间为45 min。同时，为避免跑台环境刺激的干扰，减少各组小鼠运动之外的刺激差异，每天将WTC组和ADC组小鼠置于安静跑台相同时间。

1.3 取材

12周正式运动结束后，小鼠禁食12 h，取各组小鼠18只，异氟烷吸入法麻醉后脱颈处死，取海马组织，置液氮降温后转移至-80℃冰箱保存待测。各组余6只小鼠，腹腔注射10%的水合乙醛（3.5 ml/kg）麻醉后，进行心脏灌注法固定，先用0.9%的生理盐水灌注，待肝脏变白后改用4%多聚甲醛灌注固定，至小鼠身体僵直变硬后取全脑，并将全脑置入4%多聚甲醛浸泡固定24 h后，进行脱水、石蜡包埋。

1.4 ELISA实验

取小鼠海马组织20 mg，按质量/体积比mg：μl=1：9加入预冷的1×PBS，制备海马组织匀浆，采用AMP、ATP试剂盒（上海酶联，ml6037251，ml9037510）进行ELISA实验，测定海马AMP、ATP浓度，计算AMP/ATP比值。ELISA实验基本步骤包括：试剂的室温平衡、划分板区与上样、抗体孵育、洗涤、底物反应、终止及检测、计算浓度等。

1.5 RT-qPCR实验

取海马组织20 mg，采用Trizol法加相应试剂提取海马总RNA。按照TOYOBO反转录试剂盒（FSQ-101）说明书进行反转录，制备海马cDNA。采用SYBR Green法进行RT-qPCR实验，根据所测目的基因和内参基因CT值，计算ΔCT值，采用2-ΔΔCT法计算目的基因相对表达水平。基因引物如表1所示。

表1 基因引物序列Table 1 Gene Primers Sequence

1.6 Western Blot实验

取海马组织20 mg，按mg：μl=1：7比例加入相应体积RIPA裂解液，提取海马总蛋白，BCA法测定蛋白浓度后配平，蛋白变性后，进行电泳、转膜、封闭、一抗孵育、洗涤、二抗孵育、洗涤、蛋白印迹成像，用Alpha Ease FC软件进行数据采集。抗体信息如表2所示。

表2 抗体信息Table 2 Antibody Information

1.7 免疫组织化学实验

取制备好的蜡块进行制片、脱蜡、抗原修复、内源过氧化物酶的阻断、封闭、抗体孵育（Aβ，ab2539，1：100；羊抗兔，Jackson Immuno Research，1：1 000）、DAB显色、细胞核染色、脱水封片、拍照。采用Image-Pro Plus 6.0软件，计算脑内单位面积SPs水平，本实验采用图像视野内SPs的积分光密度值（IOD sum）除以视野区域面积（area sum，即视野内的全部像素数量总和）反映单位面积内SPs水平。

1.8 数据统计

数据统计与作图采用Graphpad Prism 7.0软件，数据以均值±标准差（M±SD）表示，统计方法采用双因素方差分析（two-way ANOVA），事后检验采用Bonferroni法，以P＜0.05代表差异具有显著性，P＜0.01代表差异具有极显著性。

2 结果

2.1 小鼠海马AMP、ATP浓度及其比值结果

2.1.1 小鼠海马AMP浓度结果

基因和运动对AMP影响的主效应均不显著［F（1，20）=7.2342.707，P=0.115 5；F（1，20）=2.396，P=0.137 3］，交互作用显著［F（1，20）=7.147，P=0.014 6］。进一步分析发现，ADC组小鼠海马AMP较WTC组显著降低（P＜0.05），ADE组小鼠海马AMP较ADC组显著升高（P＜0.05，图1）。

2.1.2 小鼠海马ATP浓度结果

基因对ATP影响的主效应不显著［F（1，20）=2.396，P=0.137 3］，运动对ATP影响的主效应显著［F（1，20）=10.17，P=0.004 6］。二者对ATP的交互作用显著［F（1，20）=26.41，P＜0.000 1］。进一步分析发现，ADC组小鼠海马ATP较WTC组显著降低（P＜0.01），ADE组小鼠海马ATP较ADC组显著升高（P＜0.01，图1）。

2.1.3 小鼠海马AMP/ATP比值结果

基因和运动对AMP/ATP比值影响的主效应显著［F（1，20）=25.78，P＜0.000 1；F（1，20）=9.954，P=0.005］，二者对AMP/ATP的交互作用不显著［F（1，20）=2.221，P=0.151 8］。进一步分析发现，ADC组小鼠海马AMP/ATP比值较WTC组显著降低（P＜0.01），ADE组小鼠海马AMP/ATP较ADC组显著升高（P＜0.05，图1）。

图1 各组小鼠海马ATP、AMP及AMP/ATP水平（n=6）Figure 1. Levels of ATP，AMP and AMP/ATP in the Mice Hippocampus of Each Group

2.2 小鼠海马AMPK表达结果

2.2.1 小鼠海马AMPK mRNA表达结果

基因和运动均对AMPK mRNA影响的主效应显著［F（1，20）=15.82，P=0.000 7；F（1，20）=10.33，P=0.004 3］。二者对AMPK mRNA的交互作用不显著［F（1，20）=1.26，P=0.274 9］。进一步分析发现，ADC组小鼠海马AMPK mRNA较WTC组显著降低（P＜0.05），ADE组小鼠海马AMPK mRNA较ADC组显著升高（P＜0.05，图2）。

图2 各组小鼠海马AMPK表达结果（n=6）Figure 2. Expression of AMPK in Mice Hippocampus

2.2.2 小鼠海马AMPK蛋白表达结果

基因和运动均对AMPK 蛋白质影响的主效应显著［F（1，20）=6.631，P=0.018 1；F（1，20）=18.61，P=0.000 3］。二者对小鼠海马AMPK蛋白的交互作用不显著［F（1，20）=0.018 53，P=0.893 1］。进一步分析发现，与WTC组相比，ADC组小鼠AMPK蛋白表达有所降低，但差异不具有统计学意义（P＞0.05），而WTE组AMPK蛋白较WTC组显著升高（P＜0.05），ADE组AMPK蛋白较ADC组显著升高（P＜0.05，图2）。

2.2.3 小鼠海马磷酸化AMPK蛋白表达结果

基因和运动均对磷酸化AMPK（phosphorylation AMPK，p-AMPK）影响的主效应显著［F（1，20）=7.517，P=0.012 6；F（1，20）=9.585，P=0.005 7］。二者对p-AMPK的交互作用不显著［F（1，20）=2.583，P=0.123 7］。进一步分析发现，ADC组小鼠海马p-AMPK蛋白较WTC组显著降低（P＜0.05），ADE组小鼠海马p-AMPK较ADC组显著升高（P＜0.05，图2）。

2.3 小鼠海马Sirt1、PPARγ、PGC1α蛋白表达结果

2.3.1 小鼠海马Sirt1蛋白表达结果

基因和运动均对Sirt1 蛋白影响的主效应显著［F（1，20）=15.96，P=0.000 7；F（1，20）=10.22，P=0.004 5］。二者对Sirt1蛋白的交互作用不显著［F（1，20）=1.644，P=0.214 4］。进一步分析发现，ADC组小鼠海马Sirt1蛋白较WTC组显著降低（P＜0.01），ADE组小鼠海马Sirt1蛋白较ADC组显著升高（P＜0.05，图3）。

2.3.2 小鼠海马PPARγ蛋白表达结果

基因和运动均对PPARγ蛋白影响的主效应显著［F（1，20）=15.16，P=0.000 9；F（1，20）=7.195，P=0.014 3］。二者对PPARγ蛋白的交互作用不显著［F（1，20）=2.509，P=0.128 9］。进一步分析发现，ADC组小鼠海马PPARγ蛋白较WTC组显著降低（P＜0.01），ADE组小鼠海马PPARγ蛋白较ADC组显著升高（P＜0.05，图3）。

2.3.3 小鼠海马PGC1α蛋白表达结果

基因和运动均对PGC1α蛋白的主效应显著［F（1，20）=11.44，P=0.003 0；F（1，20）=9.747，P=0.005 4］。二者对PGC1α蛋白的交互作用不显著［F（1，20）=2.84，P=0.107 5］。进一步分析发现，ADC组小鼠海马PGC1α蛋白较WTC组显著降低（P＜0.05），ADE组小鼠海马PGC1α蛋白较ADC组显著升高（P＜0.05，图3）。

图3 各组小鼠海马Sirt1、PPARγ、PGC1α蛋白表达结果（n=6）Figure 3. Protein Expression of Sirt1、PPARγ、PGC1α in Mice Hippocampus

2.4 小鼠海马BACE1表达结果

2.4.1 小鼠海马BACE1 mRNA表达结果

基因对BACE1 mRNA影响的主效应显著［F（1，20）=14.5，P=0.001 1］，运动对BACE1 mRNA的主效应不显著［F（1，20）=3.634，P=0.071 1］。二者对BACE1 mRNA的交互作用显著［F（1，20）=5.535，P=0.029 0］。进一步分析发现，ADC组小鼠海马BACE1 mRNA较WTC组显著升高（P＜0.01），ADE组小鼠海马BACE1 mRNA较ADC组显著降低（P＜0.05，图4）。

图4 各组小鼠海马BACE1的mRNA和蛋白表达结果（n=6）Figure 4. mRNA and Protein Expression of BACE1in Mice Hippocampus

2.4.2 小鼠海马BACE1蛋白表达结果

基因对BACE1蛋白影响的主效应显著［F（1，20）=11.87，P=0.002 6］，运动对BACE1蛋白的主效应不显著［F（1，20）=1.752，P=0.200 5］。二者对BACE1蛋白的交互作用显著［F（1，20）=8.243，P=0.009 4］。进一步分析发现，ADC组小鼠海马BACE1蛋白较WTC组显著升高（P＜0.01），ADE组小鼠海马BACE1蛋白较ADC组显著降低（P＜0.05，图4）。

2.5 小鼠海马Aβ蛋白及SPs结果

2.5.1 小鼠海马Aβ蛋白结果

基因和运动对Aβ蛋白影响的主效应显著［F（1，20）=62.17，P＜0.000 1；F（1，20）=23.05，P=0.000 1］。二者对Aβ蛋白影响的交互作用不显著［F（1，20）=3.311，P=0.083 8］。进一步分析发现，ADC组小鼠海马Aβ蛋白较WTC组极显著性升高（P＜0.01），ADE组小鼠海马Aβ蛋白较ADC组极显著性降低（P＜0.01，图5）。

2.5.2 小鼠海马SPs结果

基因和运动对SPs影响的主效应显著［F（1，20）=140.5，P＜0.000 1；F（1，20）=18.46，P=0.000 4］。二者对SPs的交互作用不显著［F（1，20）=2.618，P=0.121 3］。进一步分析发现，ADC组小鼠海马SPs较WTC组显著升高（P＜0.01），ADE组小鼠海马SPs较ADC组显著降低（P＜0.01，图6）。

图5 各组小鼠海马Aβ蛋白水平（n=6）Figure 5. Aβ Protein Level in Mice Hippocampus of Each Group

图6 各组小鼠海马Aβ蛋白和SPs水平（n=6）Figure 6. SPs Level in Mice Hippocampus of Each Group

3 讨论

3.1 运动对小鼠AMPK-BACE1通路的影响

海马能量代谢减退可能导致和加剧AD病理。研究证实，能量代谢不足可上调Aβ的产生和沉积，其分子机制与AMPK-BACE1通路有关（Wang et al.，2013），该通路包括AMPK、Sirt1、PPARγ、PGC1α、BACE1等几个关键基因。本研究证实，12周跑台运动可降低6月龄APP/PS1小鼠海马Aβ，而运动对Aβ的这一抑制效应是否与上述通路有关，目前尚不清楚。因此，为探讨运动下调BACE1基因表达，减少Aβ的分子机制，本实验对AMPK-BACE1通路关键基因及相关因素进行了系统研究。

3.1.1 运动对小鼠海马AMPK的影响

AMPK是机体能量代谢的开关，对细胞能量代谢稳态起关键作用。AMPK活性受AMP/ATP调节，即AMP/ATP比值增高，AMPK活性增强，比值下降，AMPK活性降低（Ke et al.，2018）。p-AMPK是AMPK的活性形式，其表达水平反映了AMPK活性水平。

AMPK活性降低可加剧AD病理。对6月龄APP/PS1小鼠的研究证实，大脑海马p-AMPK降低，Aβ增多（Ou et al.，2018）。7月龄APP/PS1小鼠海马p-AMPK显著低于野生对照组，二甲双胍可上调APP/PS1小鼠海马p-AMPK，下调BACE1，改善AD病理（Pedros et al.，2014）。上述研究提示，AMPK与AD病理密切相关，AMPK活性下降可能诱发AD病理。与上述研究一致，本研究证实，6月龄APP/PS1小鼠（ADC组）海马AMPK mRNA和p-AMPK均显著低于同月龄WTC组水平，提示其AMPK活性下降。尽管两组间AMPK mRNA存在显著差异，但两组间AMPK蛋白水平差异不具有统计学意义（P＞0.05），进一步分析认为，造成这一现象的原因可能与两组小鼠AMPK蛋白的降解程度不同有关，并且，磷酸化形式的AMPK（p-AMPK）可能更容易降解，本研究结果显示，WTC组小鼠海马p-AMPK显著高于ADC组，这可能是导致两组AMPK蛋白差异不明显的原因。本研究同时证实，APP/PS1小鼠海马AMP、ATP浓度及AMP/ATP比值显著低于WTC组，进一步佐证了APP/PS1小鼠海马AMPK活性的下降。另外，本研究证实APP/PS1小鼠海马ATP含量降低，提示，该模型小鼠脑能量代谢受阻，脑内可能存在低能量代谢应激。

研究证实，上调脑p-AMPK，可提高AMPK活性，继而减少脑内Aβ的生成（Vingtdeux et al.，2010；Zhu et al.，2013），这可能是AD治疗的一个有效靶标。对骨骼肌和脑组织的研究均证实，运动可上调AMPK活性（Ke et al.，2018；Kjobsted et al.，2017；Krishna et al.，2017）。本研究也证实，12周跑台运动可上调APP/PS1小鼠海马AMPK mRNA水平，同时上调AMPK和p-AMPK的蛋白表达水平，进一步佐证了运动可增强APP/PS1小鼠海马AMPK活性。本研究同时证实，12周跑台运动可增加APP/PS1小鼠海马AMP、ATP含量，上调AMP/ATP比值，进一步证明了运动对海马AMPK的激活效应。综上研究提示，6月龄APP/PS1小鼠海马AMPK活性下降，ATP含量降低，脑内存在相应能量代谢应激，12周跑台运动可上调AMPK活性，改善海马能量代谢。

3.1.2 运动对小鼠海马Sirt1表达的影响

Sirt1是一种NAD依赖性去乙酰化酶，可调控基因的表观遗传学沉默，与能量代谢相关，上调Sirt1可增强胰岛素敏感性（Liu et al.，2016）。另外，Sirt1与AD病理密切相关。研究证实，Sirt1可促进Aβ降解，抑制Aβ造成的神经凋亡，Sirt1不足，认知功能下降（Chen et al.，2016；Cho et al.，2015；Kumar et al.，2017）。激活中枢神经系统Sirt1可延缓AD转基因小鼠的神经退变进程，抑制Aβ生成（Hou et al.，2016；Marques et al.，2012）。研究证实，2、4、6月龄3xTg-AD小鼠海马Sirt1水平持续下降，脑内Aβ增多（Torres-lista et al.，2014）。上述研究提示，Sirt1可抑制脑内Aβ生成，Sirt1表达不足可导致脑内Aβ增多，加速AD病理。本研究证实，与WTC组相比，ADC组小鼠海马Sirt1蛋白表达降低，与上述研究结果一致，提示，Sirt1参与了APP/PS1小鼠病理进程。上调Sirt1表达，可能有助于改善AD病理。研究证实，6个月跑轮运动可上调3xTg-AD小鼠脑内Sirt1表达，改善其认知功能（Revilla et al.，2014）。本研究证实，12周跑台运动可上调APP/PS1小鼠海马Sirt1蛋白表达，抑制脑内Aβ，与上述研究结果一致。

3.1.3 运动对小鼠海马PPARγ表达的影响

PPARγ可抑制AD病理。有研究发现，β-丁香烯可激活大麻素受体2和PPARγ通路，减少APP/PS1小鼠大脑Aβ沉积，改善认知功能（Cheng et al.，2014）。传统中药三七可激活PPARγ，减少6月龄APP/PS1小鼠脑内Aβ沉积，改善小鼠认知功能，而采用PPARγ拮抗剂GW9662则可阻断这一效应（Li et al.，2015）。对8月龄APP/PS1小鼠腹腔注射姜黄素4周，可激活PPARγ，抑制Aβ沉积，改善小鼠记忆能力，PPARγ拮抗剂GW9662同样也可阻断这一效应（Liu et al.，2016）。综上研究提示，PPARγ可通过抑制Aβ，改善AD病理，PPARγ表达及活性降低可能与大脑认知功能障碍有关。本研究证实，6月龄APP/PS1小鼠海马PPARγ蛋白表达显著低于WTC组，12周跑台运动可上调海马PPARγ表达，提示，PPARγ表达下调可能介导了6月龄APP/PS1小鼠海马Aβ的大量沉积，而12周跑台运动可抑制这一现象。

3.1.4 运动对小鼠海马PGC1α表达的影响

PGC1α是线粒体生物发生的主要调节蛋白，是调节细胞能量代谢相关基因的转录共激活因子（Dorn et al.，2015；Sanchis-gomar et al.，2014；Valero et al.，2014）。通过核受体PPARγ，PGC1α可与多种转录因子相互作用，调控相关基因的转录与翻译。近期研究证实，PGC1α可抑制Aβ生成（Xia et al.，2017）。AD患者大脑PGC1α表达下降，且伴有线粒体功能异常（Austin et al.，2012；Sweeney et al.，2016）。研究证实，自3月龄开始，APP/PS1小鼠海马即表现出PGC1α蛋白表达下降（Ettcheto et al.，2016）。上述研究提示，PGC1α表达下调可能参与了AD病理进程。本研究证实，6月龄APP/PS1小鼠海马PGC1α蛋白表达显著降低，提示，PGC1α表达下调可能介导了该模型小鼠的病理进程，这可能和本实验中6月龄小鼠所表现出的能量代谢减退有关。PGC1α蛋白表达受Sirt1调控，Sirt1可与PGC1α绑定结合，并通过去乙酰化作用激活PGC1α（Gurd，2011；Yu et al.，2018）。近年来的研究显示，运动可上调PGC1α蛋白表达（Erlich et al.，2018）。本研究也证实，12周跑台运动可显著上调PGC1α蛋白质表达水平，这可能和运动抑制APP/PS1小鼠海马Aβ，改善AD病理有关。有研究显示，AMPK可通过调节NAD+/NADH调控Sirt1表达，Sirt1还可影响PGC1α、PPARγ等能量代谢调控因子（Chen et al.，2016；Shin et al.，2014）。提示，12周跑台运动上调PPARγ和PGC1α表达，改善APP/PS1小鼠病理的机制可能和激活AMPK，进而上调Sirt1表达有关。

3.1.5 运动对小鼠海马BACE1及海马区Aβ沉积的影响

BACE1是AD病理中重要的β-裂解酶。Aβ学说认为，正常情况下，APP经α-裂解酶裂解生成C83片段，C83再经γ-裂解，此过程不产生Aβ，而在衰老和AD病理进程中，更多的APP经β-裂解酶裂解产生C99片段，再经γ-裂解产生神经毒性物质Aβ，可见BACE1在AD病理中扮演着重要角色。对11月龄APP/PS1雌性小鼠的研究证实，上调BACE1，脑内Aβ沉积增多，下调BACE1，脑内Aβ沉积减少（Li et al.，2015）。该研究结果提示，BACE1是介导脑内Aβ沉积的关键，BACE1的表达变化可作为评价AD病理的一个重要指标。

本研究证实，6月龄APP/PS1小鼠海马BACE1基因mRNA和蛋白表达均显著高于WTC组，大脑海马区Aβ蛋白增多，SPs增多，提示，6月龄APP/PS1小鼠海马β-裂解作用增强。然而也有研究显示，6月龄APP/PS1小鼠脑Aβ沉积增多，SPs周围BACE1聚集增多，学习记忆能力下降，但与野生对照组相比，BACE1蛋白表达未表现出显著性差异（Luo et al.，2016）。进一步分析认为，检测组织不同可能是造成检测结果不同的主要原因，该研究检测组织为全脑，而本研究检测的是海马组织，海马是学习记忆的关键脑区，在衰老和AD病程中，海马首先受到侵害。6月龄APP/PS1小鼠可能尚未表现出全脑BACE1蛋白上调，如脑干、小脑等脑区尚未发生相应的病理学变化，当提取整个脑组织蛋白时，其海马BACE1蛋白的有限上调可能会被全脑组织蛋白所稀释。

下调BACE1可能有利于AD病理改善。对7月龄APP/PS1小鼠补充8周叶酸可显著下调BACE1基因的转录与翻译，减少脑内Aβ，改善AD病理（Tian et al.，2016）。5个月中等强度跑台运动可降低10月龄APP/PS1小鼠海马及皮质BACE1蛋白，减少Aβ沉积（Zhang et al.，2017）。与上述结果一致，本研究证实，12周跑台运动可显著降低6月龄APP/PS1小鼠海马BACE1基因的mRNA和蛋白表达，下调海马Aβ蛋白，减少SPs。提示，跑台运动可通过下调海马BACE1，改善APP/PS1小鼠病理。近期有研究认为，运动对BACE1的下调效应仅对大脑功能受损组有效，而对正常组无效（Alkadhi et al.，2018），本研究也证实，12周跑台运动并未改变WTC组小鼠海马BACE1基因的mRNA和蛋白水平。提示，12周跑台运动可能对正常组小鼠海马APP代谢无显著影响，这可能与正常组小鼠海马APP及BACE1表达较低，尚处于正常生理代谢范围有关。

3.2 运动对小鼠海马AMPK-BACE1通路影响的整体分析

海马能量代谢减退可能参与了APP/PS1小鼠的病理进程，能量代谢不足可上调Aβ的产生和沉积。有研究认为，能量代谢应激造成脑内Aβ增多的分子机制与AMPKBACE1通路有关（Wang et al.，2013）。其分子机理为，能量代谢应激可造成AMPK活性下降，继而引起Sirt1表达下降，造成Sirt1去乙酰化作用减弱，下调PPARγ及PGC1α的蛋白表达。而后两者是BACE1基因表达的关键抑制因子，二者可与BACE1基因启动子区的PPRE和YY1位点结合，抑制BACE1基因的转录与翻译。但在衰老及AD大脑中，由于AMPK活性下降，Sirt1表达下降，引起PPARγ和PGC1α表达下降，造成其对BACE1基因的转录抑制效应减弱，导致BACE1表达上调，最终增强APP的β-裂解，这被认为是能量代谢应激上调Aβ，加剧AD病理的分子机制。本研究证实，与同窝WT小鼠相比，6月龄APP/PS1小鼠海马ATP减少，AMP/ATP降低，p-AMPK降低，Sirt1、PPARγ、PGC1α蛋白表达下降，BACE1基因的mRNA和蛋白表达水平均表现为上调，与上述研究结果一致。本研究同时证实，APP/PS1小鼠海马SPs增多，进一步印证，该模型小鼠海马BACE1表达上调，APP的β-裂解作用增强。综上提示，海马能量代谢减退，可通过AMPK-BACE1通路增加6月龄APP/PS1小鼠Aβ生成，这可能是该模型小鼠脑内Aβ增多的重要机制。运动可改善脑内能量代谢，降低脑内Aβ沉积。有研究证实，12周跑台运动可上调12月龄APP/NSE雌性小鼠脑Sirt1、PGC1α蛋白表达，下调BACE1蛋白表达，最终减少Aβ生成（Koo et al.，2017）。本研究也证实，12周跑台运动可提高APP/PS1小鼠海马ATP含量，增加AMP/ATP比值，上调AMPK、p-AMPK、Sirt1、PPARγ、PGC1α等蛋白表达水平，下调BACE1基因的mRNA和蛋白表达水平，最终表现为海马区Aβ沉积的减少。综上研究提示，运动下调APP/PS1小鼠脑内Aβ，可能和运动激活AMPK，改善AMPK-BACE1通路，下调BACE1表达有关，这可能是连接“运动-脑能量代谢-Aβ-脑认知功能”的一个直接通路。

4 结论

6月龄APP/PS1小鼠海马Aβ增多的机制可能和AMPKBACE1通路异常有关，即AMP/ATP下降，AMPK磷酸化水平降低造成其活性减弱，进而下调Sirt1、PPARγ、PGC1α等蛋白表达，引起BACE1基因表达增高，上调APP的β-裂解作用，最终导致Aβ增多。

12周跑台运动减少6月龄APP/PS1小鼠海马Aβ的分子机制可能和运动改善AMPK-BACE1通路有关，即运动增加AMP/ATP比值，上调AMPK磷酸化水平，增强AMPK活性，继而上调Sirt1、PPARγ、PGC1α蛋白表达，引起BACE1基因表达下降，减弱APP的β-裂解，最终减少Aβ的生成和沉积。