牛源金黄色葡萄球菌凝固酶分型与致病因子检测

徐 结，侯 晓，张雪婧，蒲万霞

(中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所/新兽药重点开放实验室/甘肃省新兽药工程重点实验室，甘肃 兰州 730050)

奶牛乳房炎(Bovinemastitis)的防控一直都被公认为是世界性难题，它不仅使牛的产奶量下降，还影响牛奶的品质，严重影响奶牛的健康和生产性能，给乳源安全与公共卫生带来隐患，严重威胁人类的健康[1]。在奶牛乳房炎的病原中，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)一直均有较高的检出率，是导致奶牛乳房炎的主要病原菌之一[2]。由于S.aureus所引起的感染较难控制，危害性大，传播广，而且其能够产生多种致病因子，如肠毒素、血浆凝固酶、白细胞毒素、表皮剥脱毒素和溶血素等，这些致病因子还是引起奶牛乳房炎、人类尿路感染、心内膜炎、败血症、腹膜炎、骨关节疾病等各种疾病的致病原因[3]。因此很有必要对S.aureus进行准确的致病因子检测与分型研究，实时掌握其可能存在的流行特点，为临床合理用药和乳房炎的防控提供依据。

血浆凝固酶是S.aureus所特有的致病因子，能够保护其免于机体吞噬细胞的清除作用，临床上也常用来作为S.aureus的检测标识物[4]，而且是作为检测致病性S.aureus的标识物[5]。Goh等在研究S.aureus凝固酶时发现，凝固酶编码的凝固酶基因(Coa)在3'末端有一系列碱基重复序列，长度约为81 bp，不同基因型的S.aureus中其重复序列的数目也不同，通过设计特异性引物PCR扩增Coa基因，根据扩增产物片段大小进行基因分型；同时采用限制酶AluⅠ对PCR产物进行酶切，由于其酶切位点的差异性，Coa基因3'末端重复序列的可变区显示多态性，所以可以根据酶切片段的多态性来进行二次分型，用来弥补Coa基因分型精准度不足的缺点[6]。采用Coa基因分型可以很大程度上提高对S.aureus的检测效率，而且该基因分型操作简单，重复性好，可以用于S.aureus的流行病学分析[7]。本研究首次对青海和甘肃地区35株奶牛乳房炎临床分离的S.aureus进行Coa基因分型与主要致病因子的检测，并分析基因型与致病因子之间的关系，为奶牛乳房炎的防控提供可靠的流行病学依据。

1 材料与方法

1.1 样品与主要试剂 本研究所用210份奶样来自青海和甘肃地区的2个大型奶牛养殖场，其中青海地区96份奶样，甘肃地区114份奶样，利用灭菌采样管采集乳样，对奶牛的4个乳区及采样人员手臂严格消毒，弃去前两把奶，每头牛采集2份样品。Coa基因阳性S.aureus标准菌株CVCC2246和Coa基因阴性表皮葡萄球菌标准菌株CMCC(B)2606购自中国兽医药品监察所。

A luⅠ、蛋白酶K和LaTaqDNA聚合酶购自TaKaRa公司；溶菌酶(Lysostaphin)购自Sigma公司；Mueller-Hinton肉汤与固体以及甘露醇氯化钠琼脂培养基购自广东环凯微生物科技有限公司；生化鉴定微量发酵管购自兰州荣昌微生物试剂公司；脑心浸出液(BHI)培养基购自北京赛百奥科技有限公司；琼脂糖购自生工生物工程(上海)有限公司；基因组提取试剂盒购自天根(TIANGEN)生化科技有限公司。

1.2 细菌的分离鉴定 将采集的210份奶样分别取100μL均匀涂布于甘露醇氯化钠琼脂培养基上，37℃培养22 h。挑取红色菌落，接种于BHI液体培养基，然后划线于MH固体培养基上纯化培养。挑选菌落形态和镜检结果与标准S.aureus特征相一致的菌株，进行后续鉴定。

1.3 分离菌株Coa基因的PCR扩增 采用倪春霞等[8]设计的特异性引物Coa F：5'-ACCACAAGGTA CTGAATCAACG-3'/Coa R：5'-TGCTTTCGATTGTTC GATGC-3'(由北京华大基因科技公司合成)，以提取的S.aureus的基因组为模板进行Coa基因的扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4Coa基因的AluI酶切分析 根据文献[6]和限制酶说明书对S.aureus的分离株进行AluⅠ酶切反应。利用Coa基因多态性分型的区分系数[9](The numerical index of discrimination)对分离株的分型方法进行评估，通过得到的数值来判定分型方法的区分力度。公式如下：

D=区分系数；N=分型的分离株总数；s=分型数；ni=i型中分离株的数量

1.5 分离菌株致病因子的检测 以分离株的基因组DNA为模板，利用4种致病因子引物[10]对分离株进行α溶血素基因、β溶血素基因、LuKF(白细胞毒素F基因)、LuKS(白细胞毒素S基因)PCR扩增。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果与讨论

2.1 细菌的分离与鉴定结果 通过分离培养、生化鉴定，结果210份奶样中共分离得到35株S.aureus，其中甘肃地区共分离出22株S.aureus(22/114，19.3%)，青海地区共分离出13株S.aureus(13/96，13.5%)。表明，甘肃、青海两地奶样中S.aureus的分离率较低，且前者的分离率略高于后者。

2.2Coa基因的PCR扩增与酶切分析结果 自Goh等发现Coa基因可以用于对S.aureus分型以来，由于Coa基因分型方法操作简单，重复性好，费用低，全世界许多地区均采用此方法对S.aureus的基因多态性进行分型[6]。在我国，朱战波等在2007年就首先对黑龙江奶牛养殖场分离出来的26株S.aureus进行了Coa基因分型[11]。本实验以分离株的基因组为模板，利用Coa基因引物进行PCR的扩增。结果显示，35株S.aureus共扩增出5种PCR型(图1)。除PCR 1型仅存在于甘肃地区外，其它4种PCR型在两地均有检出，片段长度为800 bp的PCR 3型的分离株在两地区的数量最多，是这两个地区主要流行基因型，这表明可能由于这两个地区相距较近，而且经常性的交流与沟通，造成不同基因型S.aureus在两个地区相互传播。

图1 Coa基因的PCR鉴定Fig.1 Identification of coagulase genotype by PCR

2.3Coa基因的AluⅠ酶切分析Coa基因扩增的5种PCR型经过A luⅠ消化后共得到了8种不同的型/亚型。PCR 2型有3种不同的酶切结果，即亚型Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ(图2)，其中亚型Ⅰ仅存在于甘肃地区，亚型Ⅱ仅存在于青海地区，亚型Ⅲ在两地均存在；PCR 3型有2种不同的酶切结果，即亚型Ⅳ和Ⅴ，这两种亚型在青海和甘肃地区均存在且分布最多。其余3种PCR型均分别仅有1种酶切结果，不分亚型。结果表明，青海和甘肃两地区分离株PCR型的分布虽然有稍许差异，但在两地区却均广泛分布。

图2 Coa基因亚型的AluⅠ酶切鉴定Fig.2 Subtype identification of coagulase gene digested by AluⅠ

Coa基因的PCR产物经A luⅠ酶切出现了同种PCR型不同的酶切亚型，反应了这两个地区菌株流行具有频繁和广泛的特征，呈现出地方流行性的现象，这可能与地区的环境条件有关。其余PCR型均仅有一种酶切产物，只有一种亚型。本实验中35株S.aureus均能够通过Coa基因进行多态性分型，其分离株区分系数为0.821，这个数值超过80%，表明Coa基因分型的方法区分力度好，适合于S.aureus的基因分型。这一结果与Elizabete[12]的报道稍有不同，可能与S.aureus的地方流行性差异有关。

2.4 致病因子在基因型中的分布 以各S.aureus基因组为模板，PCR检测其致病因子。结果显示，LukS和α溶血素在所有的S.aureus中均存在，致病因子LukF和β溶血素检出率也较高，分别是30株(85.7%)和31株(88.6%)，其中致病基因β溶血素在甘肃地区检出率为95.5%(21/22)，青海地区检出率为76.9%(10/13)，致病因子LukF在甘肃地区检出率为91.0%(20/22)，青海地区检出率为76.9%(10/13)。致病因子在青海和甘肃地区均主要存在于PCR 3型的Ⅳ和Ⅴ亚型中(表1)。表明，甘肃地区致病因子LukF和β溶血素的检出率均高于青海地区，且各致病因子广泛分布于各基因型的菌株中。

表1 S.aureaus致病因子与其各PCR型分布情况Table 1 The comparison between virulence and genetype of S.aureus

致病因子溶血素和白细胞毒素是大多数致病性葡萄球菌产生的能够抵抗宿主免疫吞噬的，能够增强病原菌入侵宿主细胞能力的活性物质[13]。本研究显示4种致病因子主要存在于S.aureusPCR 3型的流行菌株中，在其2种Coa基因亚型中均有分布，这一结果表明该4种致病因子可能在奶牛乳房炎的发病过程中起到重要的作用，甘肃地区葡萄球菌总的致病因子检出率高于青海地区。

本研究结果显示甘肃地区牛源S.aureus的分离率略高于青海地区，所有分离株均能够扩增出Coa基因片段，PCR 3型是青海和甘肃地区主要流行的基因型。35株S.aureus均含有致病因子LukS和α溶血素，致病因子LukF和β溶血素检出率也很高。致病因子普遍存在于S.aureus中，这可能是该菌引起奶牛乳房炎的主要诱因，值得关注。