豚鼠不同年龄自发性骨关节炎显微变化的观察

陶剑锋 王莹 王超 张砚卓 姜旭 吴成爱

随着人们生活、工作方式的改变及社会人口的老龄化，骨关节退行性病变已成为高发疾病，其中代表性疾病之一为骨关节炎(osteoarthritis,OA)。根据WHO统计,50岁以上的人群中，OA发病率达到50%；55岁以上的人群中，OA发病率高达80%；女性发病率高于男性。OA在严重影响患者的生活质量、增加家庭负担的同时，还造成重大的社会经济损失[1]。目前认为，OA是一种多病因所致的全关节疾病，其病变部位不仅局限于软骨，亦累及滑膜、韧带以及软骨下骨。大量研究表明，软骨下骨在OA发生发展中起着重要作用。利用一种能够模拟人类关节自然退变过程的动物模型是研究该疾病发生发展的理想方式。Hartley豚鼠在OA相关研究中是一种典型的动物模型，它随着年龄的增长自发出现关节软骨的退变、降解和丢失[2]。这一动物模型能否准确模拟人类OA的发生过程，还没有得到论证。近年兴起的显微(micro)-CT，作为一种无创检测手段常被用来评价小动物的骨组织。目前该成像技术的分辨率通常在10～82 μm，可充分满足临床与动物实验对脊柱等部位的皮质骨和骨小梁结构观察及形态计量学分析的需求[3-4]。本研究选择不同年龄组的雌雄性豚鼠，通过后肢膝关节的大体形态学、X线和micro-CT检查，探讨Hartley豚鼠在不同生长阶段关节软骨和软骨下骨的改变情况与性别、体质量的相关性。

资料与方法

一、资料

1.动物与饲养：选取健康1月龄Hartley豚鼠36只(北京维通利华实验动物技术有限公司，雌雄性各18只)。饲养于北京市创伤骨科研究所动物实验室内，环境条件符合中国国家标准《实验动物环境及设施》(GB14925-2010)：饲养环境温度控制在(24±2)℃，相对湿度在40%～70%，照度昼夜明暗交替时间为12 h/12 h。实验动物自由摄入水。饲料(北京实验动物研究中心)为豚鼠专用清洁级饲料。水为专用实验动物饮用水。动物饲养管理和动物实验操作均符合《北京市实验动物管理条例》，并通过北京积水潭医院-北京市创伤骨科研究所伦理委员会的批准。饲养方式为雌雄分开，同性别群养，1个月龄组为每笼9只，随着月龄增长体质量增加，逐渐减少每笼的只数，至5个月龄时每笼6只。将不同性别的豚鼠随机分为1、3、5月龄组，每组各6只。均在达到分组月龄期2～3 d以内处死取材。

2.样本制备：经戊巴比妥90 mg/kg 腹腔内注射麻醉后腹主动脉穿刺取血处死各亚组动物(n=6)，分离血清-80℃冰箱保存。称重，每只动物统一取完整的左右后肢膝关节，剔除周围组织，用生理盐水清洗。用佳能EOS 40D数码相机、50 mm镜头(佳能公司，日本)观察关节软骨的大体形态。标本保存于-80℃冰箱中。

二、方法

1.Micro-CT扫描与三维重建：将股骨标本经保湿处理后置于Micro-CT(SKYSCAN 1172，比利时)仪器中进行扫描，扫描方式为旋转180°,步长0.4°，扫描分辨率为12 μm，管电压60 kV，管电流120 μA，曝光时间700 ms，0.5 mm铝过滤器[5-6]。扫描完毕后，采用设备自带的重构软件NRECON(V1.6.9.4)获得标本的横断面图。

为了分析软骨下骨小梁参数，选取以2.05 × 2.05 × 0.6 mm3大小的感兴趣容积(volume of interest，VOI)，采用CTAn(V1.14.4)软件完成图像二值化(阈值80～255)后并进行数据分析。比较各组VOI范围内结构模型指数(structure model index,SMI)、骨小梁模式因子(trabecular bone pattern factor,Tb.Pf)、各向异性的程度(degree of anisotropy, DA)、骨小梁厚度 (trabecular thickness, Tb.Th)和骨小梁间隙(Trabecular Separation,Tb.Sp)。

2.膝关节的X线评估:将膝关节标本置于10 cm深的水膜中，使用数字化移动式X线摄影系统 (DR,SHIMADZU MUX-200D，日本)放射成像，放射条件为55 mV，14 mAs，投照高度为100 cm。由同一位放射科医生评价各组膝关节变化情况。

结 果

一、豚鼠体质量

(1)雌性：1月龄体质量(316.3±7.2)g；3月龄体质量(583.5±57.2)g；5月龄体质量(819.8±166.3)g。(2)雄性：1月龄体质量(363±23.9)g；3月龄体质量(814.8±99.4)g；5月龄体质量(951.3±65.9)g(图1)。3月龄和5月龄雄性豚鼠体质量明显高于雌性豚鼠体质量。

二、大体观察

(1)1月龄：雌雄性豚鼠胫骨平台、股骨髁、股骨髌面等关节面光滑平整，光泽明亮，无裂纹及软化灶，关节边缘规则齐平，无骨赘形成，关节软骨外观呈半透明。(2)3月龄：雌雄性豚鼠胫骨平台、股骨髁、股骨髌面等关节面光滑平整，光泽明亮，无裂纹及软化灶，关节边缘规则齐平，无骨赘形成。(3)5月龄：雌雄性豚鼠胫骨平台、股骨髁、股骨髌面等关节面粗糙，光泽暗淡，无裂纹及软化灶，无骨赘形成(图2)。

三、膝关节X线检查

膝关节为OA的好发部位，早期常有骨摩擦音出现，这是关节软骨退行性变和破裂引起的症状，X线检查也无异常发现。与1月龄的雌雄性豚鼠膝关节相比，3月龄和5月龄雌雄性豚鼠膝关节间隙变窄。3月龄和5月龄之间关节间隙未见明显的差异，并且未见骨赘形成(图3)。

图1 雌雄性豚鼠体质量与年龄(月龄)之间的相关性(n=6)

四、Micro-CT检查

Micro-CT扫描豚鼠后肢膝关节胫骨平台软骨下骨，通过软件分析计算出ROI范围内Tb.Th、骨小梁间隙、SMI、 DA。与1月龄比较，3月龄和5月龄雌雄性豚鼠膝关节内侧Tb.Th明显增高(P<0.05)，而膝关节外侧未见明显的变化。与1月龄比较，3月龄和5月龄雌雄性豚鼠膝关节内侧和外侧SMI显著降低(P<0.05)；在3月龄和5月龄雄性豚鼠膝关节内侧和外侧，DA显著降低(P<0.05)，而雌性豚鼠膝关节内侧有显著的降低(P<0.05)。在不同的月龄、雌雄性豚鼠中Tb.Sp未见明显的变化(图4)。

讨 论

OA是一种退变性关节疾病，病变过程中可观察到关节软骨、滑膜、软骨下骨及周围软组织(肌肉、韧带等)的结构改变，表现为关节软骨失常，传导应力负荷失常，导致软骨的生物力学及生物化学环境发生改变，逐渐发生软骨的降解质变，最终发生软骨变薄、纤维化、糜烂、裂隙、肉眼下溃疡及全层关节面消失等。以往对OA的病因研究多集中于关节软骨的破坏;近期的研究认为，软骨下骨改变在OA发病过程中起着促进作用，即软骨下骨硬化与OA 的发生、发展密切相关，而不只是OA的结果。一些研究结果表明，软骨下骨动态形态的改变是OA发展中的组成部分[7-8]。这些变化与许多局部非正常生物力学通路有关，不仅影响骨的变化，而且与其他异常结构变化一起促进软骨退变[9-10]。目前软骨下骨对OA发病的先导作用并不确定，因此使用动物模型来探索其发病机制成为常用的研究手段。

图2豚鼠膝关节大体形态观察A1、3、5月龄雌性豚鼠的股骨髌面、股骨髁和胫骨平台B1、3、5月龄雄性豚鼠的股骨髌面、股骨髁和胫骨平台

图3 雌雄性豚鼠膝关节X线 A～C 雌性豚鼠 D～F 雄性豚鼠

多项研究证明，人的关节软骨与啮齿类动物模型在OA发病机制上有相似之处，如人OA软骨、小鼠和豚鼠OA模型的软骨都能分泌血管内皮生长因子[2,11-12]。 Hartly豚鼠原发性OA与人的原发性OA相似，并且是一种容易获得、价格便宜、饲养经济的动物，因此，通常被作为骨关节炎的模型[2,13]。对雄性Hartly豚鼠的研究证明，在软骨退行性变发生之前和发生时，软骨下骨脆性增强，成骨活动增强，软骨下骨参与了骨关节炎发展[13]。本研究在雌性豚鼠原发性OA的研究中发现，雌性豚鼠在30 d时形态学结果为正常软骨，90 d时其关节软骨的形态学都已经有中度以上的损害。年龄增加至210 d的豚鼠，形态学研究结果显示软骨破坏进一步加重[2]。

对人类的流行病学研究结果表明，女性在50岁以后OA发病率明显增加，中年女性膝关节OA患者的血清雌激素处于低水平状态。因此，女性OA可能与绝经后卵巢功能低下有关[14]。然而，并不是所有的妇女在绝经以后都患OA，提示激素的单独作用可能不足以导致OA。

本研究使用不同发育阶段的雌雄性豚鼠，分析了性别、年龄和体质量对膝关节软骨及软骨下骨的影响。大体形态结果显示，5月龄雌雄性豚鼠与1、3月龄相比，膝关节胫骨平台、股骨髁、股骨髌面等关节面粗糙，光泽暗淡。X线影像结果显示，随着月龄的增加，关节间隙变窄。相同月龄的雄性和雌性豚鼠之间未见明显的差异。Micro-CT分析发现Hartly豚鼠在OA发生发展过程中，在关节内侧软骨下骨Tb.Th明显增加而外侧未见显著变化；与1月龄相比，3月龄和5月龄豚鼠关节内、外侧SMI和DA显著降低，雄性和雌性豚鼠呈现相似趋势。这些改变一方面可能与豚鼠正常生长有关，另一方面，可能是OA进展的始动因素或反馈效应之一，这一问题的阐明尚有待深入研究。

综上所述，年龄增加至5月龄的豚鼠自发性地发生膝关节OA。在1、3、5月龄豚鼠原发性OA发生发展中可能与性激素水平关系不大。3月龄和5月龄雄性豚鼠体质量明显高于雌性豚鼠体质量，体质量改变是否促进OA的发展有待评估，至少在5月龄豚鼠难以确定。对于软骨和软骨下骨两者的因果关系，在3月龄和5月龄豚鼠中也暂时难以确定。未来可利用5月龄后的豚鼠进一步研究性别、体质量与OA的相关性，并且进一步阐明在OA发生发展中软骨和软骨下骨两者的相互关系。

注：a为两组间比较，差异有统计学意义，P<0.05

图4豚鼠膝关节内侧和外侧Micro-CT参数比较