河南石斛游离氨基酸超声辅助提取工艺条件的优化

郭 旭， 陈乃东， 陈乃富， 张艳晴， 王荣花， 徐文冬， 石敏珠

(1.皖西学院， 安徽 六安 237012； 2.中国人民解放军陆军军医大学 士官学校， 河北 石家庄 050083)

游离氨基酸是指天然产物中以游离状态存在的氨基酸，是一种重要生物活性物质[1]，具有维护新陈代谢、促进生长、增强免疫等功能[2-4]，在食品、药品及药用植物中广泛存在，是中药治疗疾病或滋补营养的主要成分之一，是评价中药材或食品品质的一项重要指标。河南石斛(Dendrobiumhenanense)属于兰科石斛属[5]，具有益胃生津、滋阴清热的功效[6]，具有很高的药用和观赏价值[7]。然而，对于河南石斛化学成分的研究尚处于起步阶段。为此，笔者等以河南石斛中游离氨基酸的提取得率为评价指标，对其游离氨基酸的超声辅助提取工艺条件进行筛选，为河南石斛药效物质基础研究及资源开发利用奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1石斛于2018年4月采自安徽省霍山县，经鉴定为河南石斛(Dendrobiumhenanense)。

1.1.2仪器电子分析天平(FA1004型，上海精科有限公司)、BenchTop Pro冷冻干燥机(SP Scientific，USA)、双光束紫外可见分光光度计(TU-1901型，北京普析通用仪器有限责任公司)、超声波清洗仪(东莞市协和超声波设备有限公司)等。

1.1.3试剂甘氨酸(石家庄东华金龙化工有限公司)、磷酸二氢钾(广东省精细化学品工程技术研究开发中心)、氢氧化钠(西陇科学股份有限公司)、茚三酮(上海恒远生物科技有限公司)、无水乙醇(江苏强盛功能化学股份有限公司)等均为国产分析纯。

1.2方法

1.2.1甘氨酸标准曲线的制备分别精密量取1.0 mg/mL甘氨酸溶液0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL于刻度试管中，以蒸馏水补足至10.0 mL。吸取上述各溶液2.0 mL于10 mL刻度试管中，分别加入2%茚三酮溶液1.0 mL和pH 6.8的磷酸缓冲液1.0 mL，震荡摇匀，于100℃水浴中加热15 min后冷却，蒸馏水定容至刻度，以0.0 mg/mL甘氨酸为空白对照，在570 nm波长下测定吸光度，测得标准曲线方程：A=16.34C+0.034，R2=0.991，式中，A为吸光度，C甘氨酸标准品质量浓度。

1.2.2提取工艺条件单因素试验取河南石斛新鲜茎，洗净、切片，-50℃冷冻干燥至恒重，粉碎。在预试验的基础上，用60%甲醇为提取剂[8-10]，固定超声提取温度为60℃，精密称取0.5 g干燥至恒重的河南石斛粉末若干份，按表1设计进行单因素试验，3次重复，考察超声提取时间、超声提取功率、料液比和超声提取次数对河南石斛游离氨基酸提取得率的影响。

表1不同因素提取河南石斛游离氨基酸的试验设计及水平

1.2.3提取工艺条件响应面试验根据Box-Behnken试验设计原理，选取料液比、超声提取时间、超声提取功率、超声提取次数4个影响因素，以河南石斛中游离氨基酸的提取得率为响应值(y)，根据单因素试验结果进行4因素3水平(表2)响应面分析试验，根据试验结果进行数学建模，确定超声波辅助提取的最佳工艺条件。响应面试验设计和分析采用Design-Expert10.0完成，最后进行最佳工艺条件的验证和加样回收试验。

1.2.4游离氨基酸提取得率的测定精密吸取1.2.2、1.2.3所述试验条件下提取的河南石斛提取液1.0 mL置于10.0 mL刻度试管中，按标准曲线的制备方法在570 nm处测定吸光度，代入标准曲线计算提取液中游离氨基酸浓度，进而计算出游离氨基酸的提取得率。

表2不同因素提取河南石斛游离氨基酸响应面试验设计的因素与水平

2结果与分析

2.1单因素试验

从图1可看出超声提取时间、超声提取功率、料液比和超声提取次数对河南石斛总游离氨基酸提取得率的影响。

2.1.1料液比河南石斛游离氨基酸的提取得率随着料液比的增加而增大，料液比为1∶50时达到最大值，但料液比为1∶40和1∶50时游离氨基酸的提取得率差异无统计学意义，故选择料液比1∶(20～40)做响应面优化。

2.1.2超声提取时间当超声提取时间≤40 min时，随着提取时间延长河南石斛游离氨基酸的提取得率显著升高；超过40 min后，随着提取时间延长提取得率差异不显著，超声时间30 min时河南石斛粉末中游离氨基酸已基本被提取出来，故选择超声提取时间20～40 min为后续优化的提取时间。

2.1.3超声提取功率随着超声提取功率的增加河南石斛游离氨基酸的提取得率逐渐增加，超声提取功率为240 W时达最大值，继续加大超声提取功率，提取得率下降。原因可能是超声提取功率≤240 W时，超声功率增加有利于粉末中游离氨基酸的溶出，但继续增大超声功率，提取液的流动速度加快，造成粉末在超声场中停留时间减少，导致破壁作用减弱[11]。综合考虑，选择超声提取功率120～240 W做进一步响应面优化试验。

2.1.4提取次数随着提取次数的增加河南石斛游离氨基酸的提取得率不断增大，在提取4次时基本达到稳定，再增加提取次数无显著差异，故选2～4次做进一步响应面优化试验。

图1不同因素下河南石斛总游离氨基酸的提取得率

2.2响应面试验

采用Design-Expert 10.0软件对响应面试验结果(表3)进行回归拟合，得回归方程：

y=-4.242-0.022 2A+0.107 9B+0.017 1C+1.088D-0.000 025AB+0.000 017AC-0.001 25AD-0.000 096BC-0.005 25BD-0.000 75CD+0.000 4A2-0.000 76B2-0.000 02C2-0.079 7D2

经方差分析(表4)，在各因素所选取的水平范围内，B、C、D、BC、BD、A2、B2、C2、D2所对应的P值均小于0.05，说明这几个因素对河南石斛游离氨基酸的提取得率有显著影响。根据F值大小可知，4个因素对河南石斛提取得率的影响为提取功率(C)>提取时间(B)>提取次数(D)>料液比(A)。

经Design-Expert 10.0软件分析，以60%乙醇体积为提取剂、超声提取温度60℃时，超声波辅助提取河南石斛游离氨基酸的最佳工艺条件为料液比1︰39.85(g︰mL)、超声时间30 min、超声功率240 W、提取次数3.7次。在此条件下，预测的河南石斛中游离氨基酸含量为1.979%。考虑实际操作条件，将条件定为料液比1︰40、超声时间30 min、超声功率240 W、提取次数4次。

表3河南石斛游离氨基酸提取响应面试验结果

注：实测值为3次重复试验的平均值。

Note:Measured value is the mean value of three repetitions.

表4响应面试验方差分析结果

2.3最佳工艺条件的验证

2.3.1验证试验在最佳条件下进行验证试验，河南石斛的游离氨基酸含量为(1.95±0.12)%，与理论值相近，说明响应面法优化得到的工艺条件相对可靠。

2.3.2加样回收试验精密称取河南石斛样品6份，各0.5 g，分别加入甘氨酸10.0 mg，按最佳工艺条件提取，计算回收率和RSD，测得加样回收率在94.2%～103.5%，RSD=4.2%，加标回收率满足试验要求，表明本测定方法稳定可靠。

3结论

在单因素试验基础上利用响应面法，通过二次回归计算构建河南石斛游离氨基酸提取得率与超声提取时间、超声提取功率、料液比、超声提取次数关系的回归模型，回归方程：y=-4.242-0.022 2A+0.107 9B+0.017 1C+1.088D-0.000 025AB+0.000 017AC-0.001 25AD-0.000 096BC-0.005 25BD-0.000 75CD+0.000 4A2-0.000 76B2-0.000 02C2-0.079 7D2，R2=0.989 9，利用模型对影响超声波辅助提取河南石斛游离氨基酸的4个关键因素及其相互作用进行分析，得到最佳提取条件为料液比1︰40(g︰mL)、超声时间30 min、超声功率240 W、提取次数4次，在此条件下河南石斛的游离氨基酸含量为(1.95±0.12)%。