碱性电解水对籽瓜种仁蛋白质提取效果的影响

李志豪，周 彬，王 萍，余雄伟，付琴利，李述刚,*

（1.湖北工业大学生物工程与食品学院，菲利普斯亲水胶体研究中心，湖北 武汉 430068；2.塔里木大学生命科学学院，南疆特色农产品深加工兵团重点实验室，新疆 阿拉尔 843300；3.武汉旭东食品有限公司，湖北 武汉 430068）

籽瓜（Citrullus lanatus var. megalaspermus）为葫芦科西瓜属植物[1]，其种仁中蛋白质量分数高达36%～40%，且其必需氨基酸的比例相比于大豆更接近联合国粮食及农业组织（Food and Agriculture Organization，FAO）推荐值。此外，籽瓜种仁蛋白酶解产物具有很高的抗氧化活性，以2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)阳离子自由基清除能力与螯合Fe2+的能力较为突出，是一种值得开发的蛋白资源[2]。

碱溶酸沉法是目前运用最广泛的一种植物蛋白提取方法，但是在高碱性条件下蛋白质分子容易水解，次价键和氢键容易断裂，且在提取过程中会产生一些非蛋白质的副产物，影响了其推广应用[3]。电解水也称为离子水，可通过在纯水溶液两端添加电极的方式获得[4]。当水溶液中添加外部电场时，带电物质往相反电荷的电极移动，会产生大量的H+和OH-，加上电解时间和电解质的不同，溶液的pH值随之发生改变。

电解水一般分为强电解水（主要包括强酸性电解水和强碱性电解水）和弱电解水（主要包括微酸性电解水和弱碱性电解水）。碱性电解水具有较高的负电位和还原能力，可以清除体内多余的自由基，所以对多种老年病（心脑血管疾病、肿瘤、糖尿病等）具有一定的辅助抗病功效[5]。因为碱性电解水具有容易进入细胞间隙、渗透能力强和对环境无污染等特点[6-7]，Kobayashi等利用pH 3的强酸性电解水来提取桑叶中的有效成分1-脱氧野尻霉素，其提取率比用自来水提取提高了3%[8]。Tamaki[9]、Watanabe[10]等通过改变电解过程中的电解质来调节溶剂pH值，在不添加酸或碱的情况下，不仅提高了米糠蛋白质的提取率，而且促进了海水的淡化。Toge等利用碱性电解水有效的提高了海水鱼油的提取率[11]。Nabok等利用电解水提取葵花籽蛋白质，与传统的碱溶酸沉法相比，蛋白质的提取率提高了10.4%[12]。

综上所述，为了获得一种新型的籽瓜种仁蛋白质提取方法，本实验以籽瓜种仁蛋白质为研究对象，对比分析电解水与超纯水对籽瓜种仁蛋白质的提取率、结构和功能特性方面的影响。分析探讨碱性电解水提取方法对籽瓜种仁蛋白质结构和功能影响的内在机制，旨在为植物坚果蛋白质的高效绿色提取制备提供技术支撑，以促进籽瓜种仁等植物坚果蛋白质资源的开发与利用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

籽瓜种仁由新疆建设兵团第一师九团十连园艺场提供。

电解水（pH 8） 深圳市润正电解技术有限公司；牛血清白蛋白 美国Sigma公司；8 000～14 000 Da透析袋美国Biosharp公司；其他试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Nicoletis50傅里叶变换红外光谱仪、Micro 21R高速冷冻离心机 美国Thermo Fisher公司；YB-FD-1冷冻干燥机 上海亿倍实业有限公司；J-1500圆二色光谱仪日本JASCO公司；SU-8010扫描电子显微镜、L-8900氨基酸分析仪、F4600荧光分光光度计 日本日立公司；DYY-8C电泳仪 北京六一公司；NanoZS纳米粒度分析仪 英国Malvern公司。

1.3 方法

1.3.1 籽瓜种仁基本成分的测定

蛋白质量分数的测定参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》中微量凯氏定氮法。脂肪质量分数的测定参照GB 5009.6—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》。灰分质量分数的测定参照GB 5009.4—2016《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》。水分质量分数的测定参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》。还原糖质量分数的测定参照GB 5009.7—2016《食品安全国家标准 食品中还原糖的测定》。

1.3.2 样品的制备与提取率的计算

籽瓜种子去壳、磨粉，称取5 g用石油醚（30～60 ℃）按料液比1∶30脱脂，抽滤、挥发石油醚（重复脱脂一次），得到脱脂籽瓜种仁粉，对石油醚进行回收。精确称取等质量脱脂粉末并分别加入电解水（pH 8）和超纯水，按料液比1∶30混匀，用1.0 mol/L NaOH溶液调节pH值分别为8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，在35 ℃水浴锅中磁力搅拌提取3 h，提取液采用冷冻离心机5 000 r/min离心15 min，取上清液，用相同提取液洗涤残渣并离心15 min，重复两次。合并上清液，用1.0 mol/L HCl溶液调节pH值至4.5，离心15 min，取沉淀溶解于100 mL超纯水中，调节pH值至7.0，装入截留分子质量8 000～14 000 Da的透析袋中透析72 h。经冷冻干燥获分别得电解水提取的籽瓜种仁蛋白质（electrolyzed water extracted seed kernel protein，EWP）和超纯水提取的籽瓜种仁蛋白质（ultrapure water extracted seed kernel protein，UWP），将样品置于冰箱4 ℃冷藏备用。

用考马斯亮蓝法测定上清液蛋白质量浓度。以牛血清白蛋白为标准品绘制标准曲线，建立回归方程：Y＝0.448 6X+0.019 9（R2＝0.998 4）。式中：X代表蛋白质量浓度/（mg/mL），Y代表吸光度。

籽瓜种仁分离蛋白提取率按下式计算。

1.3.3 提取方法对籽瓜种仁蛋白质成分的影响

氨基酸组成参照GB 5009.124—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》中方法测定。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳参考Wu Wei等[13]的方法，浓缩胶质量分数为5%，分离胶质量分数为12%。

1.3.4 提取方法对籽瓜种仁蛋白理化特性的影响

粒径采用纳米粒度分布仪测定。表面疏水性参照Kato等[14]的方法测定。游离巯基和二硫键含量参照Beveridge等[15]的方法测定。

1.3.5 不同提取方法对籽瓜种仁蛋白结构特性的影响

1.3.5.1 傅里叶变换红外光谱分析

采用KBr压片法，扫描范围为400～4 000 cm-1，对所有数据进行背景与基线校正。

1.3.5.2 圆二色光谱分析

在波长范围190～250 nm、分辨率0.1 nm、响应时间1 s条件下进行3 次扫描，取平均值。

1.3.5.3 扫描电子显微镜观察

使用扫描电子显微镜观察显微照片。将样品涂抹在双面导电黏合剂上，喷金。在15.0 kV的二次电子模式下进行扫描电子显微镜观察。

1.3.6 提取方法对籽瓜种仁蛋白功能特性的影响

参照Bera等[16]的方法测定籽瓜种仁蛋白的溶解性。乳化性和乳液稳定性参照Pearce等[17]的方法测定。根据Bandyopadhyay等[18]的方法测定起泡性和泡沫稳定性。

1.4 数据统计与分析

2 结果与分析

2.1 籽瓜种仁常规营养成分分析

籽瓜种仁营养成分丰富，其中粗蛋白高达（36.87±0.97）%（质量分数，下同）、粗脂肪（45.96±1.13）%、还原糖（8.56±0.31）%、水分（4.93±0.12）%、灰分（3.42±0.05）%，说明其是一种重要的植物蛋白质和油料资源。

2.2 提取方法对籽瓜种仁蛋白提取率的影响

图1 提取方法对籽瓜种仁蛋白提取率的影响Fig. 1 Effect of extraction methods on the extraction rate of EWP and UWP

如图1所示，随着pH值的升高，籽瓜种仁蛋白质的提取率也随之增大，且电解水对籽瓜种仁蛋白的提取率显著高于超纯水，并在pH 10.0时达到最高，为90.07%。这可能是由于电解水中含有较多OH-，有利于H+脱离碳原子或硫酸盐基团和氢键的断裂，使蛋白质表面电荷数增加，促进了蛋白质间的静电排斥和水合作用，使其更易溶解。

在较高的pH值条件下，籽瓜种仁中的多酚易氧化为醌类物质，而醌类易与蛋白质的游离巯基和氨基发生迈克尔加成反应[19]，从而发生明显的褐变现象，即在pH＞10时提取液褐变显著[20]。因此，为了避免出现严重褐变反应，本实验选取的提取液最适pH值为9.5。

2.3 提取方法对籽瓜种仁蛋白质成分的影响

图2 EWP和UWP的凝胶电泳分析Fig. 2 Gel electrophoresis of EWP and UWP

由图2可知，籽瓜种仁蛋白质分子质量分布集中在20～21、40～41、46～47 kDa之间，EWP与UWP在分子质量上无明显差异。

表1 籽瓜种仁蛋白氨基酸组成分析Table 1 Amino acid composition analysis of EWP and UWP

由表1可知，EWP的纯度较高，且半胱氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸含量显著大于UWP（P＜0.01，P＜0.05），天冬氨酸、谷氨酸含量极显著小于UWP；其中缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸为人体必需氨基酸，且缬氨酸、异亮氨酸的含量远远超过FAO标准。另外，EWP中的半胱氨酸含量显著高于UWP，可能是因为半胱氨酸是对氧化修饰最敏感的氨基酸之一，且二硫键是在蛋白质多肽链半胱氨酸之间形成的[21]。

2.4 提取方法对籽瓜种仁蛋白理化特性的影响

二硫键是蛋白质多肽链的两个半胱氨酸之间形成的共价键，是衡量蛋白质的空间结构及其功能的重要指标。在图3A中，EWP的游离巯基含量（14.85 μmol/g）显著高于UWP（13.92 μmol/g），二硫键含量（3.82 μmol/g）略低于UWP（4.26 μmol/g）。出现这种现象可能是因为电解水中的电解质使二硫键断裂，导致蛋白质分子质量变小，溶解性增加[22-23]。EWP中的二硫键含量高于UWP，也证明了EWP中的半胱氨酸含量高于UWP。

图3 提取方法对籽瓜种仁蛋白理化特性的影响Fig. 3 Effect of extraction methods on physicochemical properties of EWP and UWP

蛋白质的表面疏水性在评价蛋白质物理化学性质和构象变化的过程中起着至关重要的作用，可以反映蛋白质分子间相互作用的能力，是反映蛋白质表面疏水性氨基酸含量的一个重要指标，与蛋白质的功能性质密切相关[14]。如图3B所示，EWP的表面疏水性高于UWP，这是因为提取过程中电解水中的离子强度较高，通过静电屏蔽效应降低了胶体颗粒的表面电势，从而增加了非极性基团间的疏水作用[24]。有研究报道在一定范围内，蛋白质疏水性越大，暴露出来的疏水性残基越多，与味蕾接触产生的苦味越明显，对食品的感官品质造成了不良影响[25]。

激光纳米粒度测定仪可对样品的可溶性部分进行测定，其结果一定程度上可以反映籽瓜种仁蛋白质的聚集程度。如图3C所示，EWP中的粒径分布在105.7～122.4 nm范围内，UWP中的粒径分布在295.3～396.1 nm范围内。这可能是由于在使用超纯水提取过程中添加的碱溶液使籽瓜种仁蛋白质的肽链降解，分子结构展开，所以暴露的疏水基团之间的相互作用强，且UWP的疏水性高于EWP，所以UWP中更加容易生成可溶性的聚集体，导致其平均粒径变大。

2.5 提取方法对籽瓜种仁蛋白结构特性的影响

图4 提取方法对籽瓜种仁蛋白结构特性的影响Fig. 4 Effect of extraction methods on the Fourier transform infrared spectroscopy and circular dichroism spectra structure of EWP and UWP

傅里叶变换红外光谱和圆二色光谱是广泛运用于食品蛋白质结构分析中的技术，其可准确地分析蛋白质二级结构中α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲结构所占的比例[26-27]。由图4A可知，酰胺I带1 600～1 700 cm-1出现强吸收峰，利用PeakFit软件的高斯曲线拟合峰面积计算得到籽瓜种仁蛋白质的二级结构如表2所示，EWP中α-螺旋结构的比例相比于UWP明显提高，β-折叠结构比例有所下降。在图4B中也可以看出类似的现象，EWP中α-螺旋所占比例大于UWP，因为α-螺旋与β-折叠结构较为有序，β-转角和无规卷曲结构较为无序，所以在EWP中的有序结构比例之和大于UWP。α-螺旋结构比例的降低可能是因为碱性电解水使籽瓜种仁蛋白质从致密有序的结构转变为松散无序的结构，从而使得蛋白质分子在一定程度上拉伸，这与沈琼等的研究结果[28]基本一致。

表2 提取方法对籽瓜种仁蛋白结构特性的影响Table 2 Effect of extraction methods onthe secondary structure of EWP and UWP

2.6 提取方法对籽瓜种仁蛋白功能特性的影响

评价一种蛋白质功能特性优劣的指标通常有蛋白质的溶解性、乳化性和起泡性等。蛋白质溶解性在很大程度上可表征蛋白质的水合作用能力，也可以用来简单地表征籽瓜种仁蛋白质的聚集和变性程度。由图5A可知，EWP的溶解性为13.14 mg/mL，UWP的溶解性为9.42 mg/mL。这可能是因为在EWP提取过程中添加了大量的电解质，使蛋白质的三级结构延伸，蛋白分子展开，结构变得松散，从而提高了其溶解性[29]。

蛋白质的乳化效果主要依靠降低油-水界面的张力来控制吸附层油滴的扩散和聚集。如图5B所示，在乳化性方面，EWP（937.58 m2/g）显著高于UWP（753.34 m2/g），然而其乳化稳定性（29.63 min）却略低于UWP（32.16 min）。这可能是因为在提取过程中，由于电解水中电解质的作用使籽瓜种仁蛋白质多肽链断裂，使其易于扩散，进而提高了其溶解性，增强了蛋白质与脂质之间的相互作用[18]。

图5 提取方法对籽瓜种仁蛋白功能特性的影响Fig. 5 Effect of extraction methods on functional characteristics of EWP and UWP

蛋白质起泡特性包括起泡性和泡沫稳定性，前者指在一定条件下产生泡沫的量，后者则是所形成泡沫的稳定性。如图5C所示，EWP的起泡性为26.00%，泡沫稳定性为45.45%；UWP的起泡性为23.10%，泡沫稳定性为64.17%。这可能是因为EWP表面疏水性较大，游离巯基含量较高，使其在泡沫膜吸附层中分子间产生疏水相互作用的机会增大，增加了蛋白质分子表面疏水性氨基酸残基的暴露，从而提高了其起泡能力[30-31]。

2.7 提取方法对籽瓜种仁蛋白微观结构的影响

扫描电子显微镜通常用于二次电子信号成像观察样品表面形态。由图6A、B可知，在1 000 倍扫描电子显微镜下，EWP结构均一、状态较为分散；而UWP则聚集成团、分散不均匀。通过4 000 倍扫描电子显微镜下的图6C、D可更为清晰地观察到这一现象：EWP粉末上附着着大小较为均一的细小颗粒，而UWP颗粒较大且大小不等、形态各异。扫描电子显微镜观察结果进一步说明了碱性电解水对籽瓜种仁蛋白质结构和功能特性的影响。

图6 EWP和UWP的扫描电子显微镜图Fig. 6 Scanning electron microscope images of EWP and UWP

3 结 论

本研究利用电解水提取籽瓜种仁蛋白质，通过对比EWP和UWP的提取率、功能特性、理化特性、结构特性，结果表明：在pH 8.5～10.0条件下，电解水提取籽瓜种仁蛋白质的提取率比超纯水高0.4%～3.1%，且EWP中的必需氨基酸含量较高，溶解性、乳化性、起泡性等较好；EWP的游离巯基含量显著高于UWP，二硫键含量略低于UWP，表面疏水性较高，粒径分布范围较小，α-螺旋和β-折叠等有序结构较多；扫描电子显微镜观察结果显示EWP结构较为有序，外观形态分散均一。此外，在制备碱性电解水的过程中无污染，对资源环境友好。因此，在今后的蛋白质工业生产中可直接利用电解调节提取溶剂pH值的方法降低碱液的用量，从而减小对环境的污染。