蚯蚓粪肥输入促进水稻土有机磷矿化的机制研究

张峰 ，王荣萍*，梁嘉伟，吴永贵，王现洁，廖新荣

1. 贵州大学资源与环境工程学院，贵州 贵阳 550025；2. 广东省生态环境技术研究所/广东省农业环境综合治理重点实验室，广东 广州 510650

磷是植物体中除碳、氢、氧、氮外含量最为丰富的元素，其参与植物体内诸多代谢过程（Vance et al.，2003；Lynch，2007）。土壤作为植物磷的主要供给来源，其中的磷素含量和活性与植物的生长发育密切相关，而土壤中能被植物直接吸收利用的磷含量极低且易被矿物质和有机质等固定。据统计，全球耕地约43%缺磷，磷已成为全球农业生产的一大重要限制因子（Su et al.，2015）。施用磷肥是补充土壤有效磷最快、最有效的途径，然而磷肥当季利用率不高，施入土壤中的磷有80%－93%被蓄积在土壤中而难以被植物利用（闫湘等，2008；赵伟等，2018）。磷肥的低利用率导致农业生产中为追求产量而对其过度投入，不仅造成资源浪费，同时存在抑制土壤微生物活性，土壤养分失调，重金属和磷蓄积以及土壤酸碱化等潜在危害，严重影响土壤各方面能力（Hinsinger，2001；白文娟等，2018）。因此如何在不降低土壤质量前提下提高施入土壤中的磷素利用率，促进土壤磷循环是当今农业生产以及农业污染防治上亟需解决的重要问题。

化肥养分含量高，肥效快，但存在持续作用时间短和营养单一等问题，而有机肥与之相反，其富含有机质，可通过不断矿化释放养分，肥效缓慢，但能对植物所需各种养分进行持续补充，同时对土壤理化环境和微生物环境具有明显改善效果。有机磷作为土壤磷库重要组成部分，占土壤总磷的20%－80%（刘涛等，2016），土壤有机磷矿化在植物磷营养中占据重要地位，有研究表明，土壤有机磷年矿化率在2%－4%范围内，数量较少，但在自然条件下可以有效提高土壤速效磷水平（赵少华等，2004）；Dodd et al.（2015）采用 Bowman-Cole有机磷分级研究发现，土壤有效磷与活性有机磷、中活性有机磷以及中稳性有机磷的相关性均显著，表明有机磷库矿化可直接对土壤有效磷源进行补充。蔡观等（2017）的研究更进一步证明自然条件下旱地土壤有机磷矿化是有效磷的主要来源。蚯蚓粪肥是蚯蚓利用土壤有机质所产生的排泄物，区别于普通堆肥产物，其养分全面，且具有优良的物理化学以及生物学性质，近几年在农业领域被广泛研究（Bhat et al.，2018；Abdissa et al.，2018；单颖等，2017）。本研究通过盆栽试验探讨分析蚯蚓粪肥添加对小白菜（Brassica chinensisL.）生长和磷素吸收的影响，以及蚯蚓粪肥添加下土壤中各形态有机磷质量浓度和微生物活性的变化，旨在为更合理利用磷肥以及保护有限耕地资源提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试土壤为河流冲击物母质发育而来的多年耕水稻土，属壤质粘土，采自广州市南沙农业科学研究院农业推广基地（22°43′N，113°33′E）。土壤采集后置于阴凉干燥处自然风干，去除小石块、动植物残体后碾碎过3 mm筛，密封保存备用。供试蚯蚓粪肥来自广东省清远市佛冈沃土农业科技有限公司（主要原料为禽畜粪便和作物秸秆），使用前对其进行自然风干，研磨后过2 mm筛，密封保存备用，取部分蚯蚓粪肥提取水溶态有机质（DOM）进行分级，经测定其不同分子量（＜14000 Da、14000－3500 Da、＞3500 Da）DOM 质量分数分别为78.76 、410.77、597.75 mg·kg-1。供试土壤和蚯蚓粪肥基本理化性质见表1。

试验所用无机肥为尿素（N 46.1%）、磷酸二氢钾（P2O545.9%，K2O 20.4%）和氯化钾（K2O 60.4%）。供试小白菜为优选上海青（江西省丰城市航城种业有限公司），种子于育苗盘育苗至第 3片真叶长出即开始移栽。

1.2 试验设计

试验在温室大棚内进行，采用单因素随机区组设计，蚯蚓粪肥设置4个水平，分别为对照（CK，0 g·kg-1）、低量（A1，40 g·kg-1）、中量（A2，80 g·kg-1）、高量（A3，120 g·kg-1），4 次重复。化肥按比例 N∶P2O5∶K2O=1.5∶1.0∶1.5 添加，即尿素 332 mg·kg-1、磷酸二氢钾 192 mg·kg-1、氯化钾 182 mg·kg-1。试验每盆装土1 kg，化肥和蚯蚓粪与土混合均匀后装盆，分层压紧，保持一定土面高度，并且加水调节土壤含水量至田间最大持水量的60%。每盆移栽3棵小白菜，在培养期间每天定时称重定量补水。在小白菜培养的第0天、7天、14天、21天破坏性采集土壤样品，在第 35天（收获期）分别采集根际土、非根际土，测定各项指标。

1.3 主要指标测定方法

DOM采用透析袋法分级，TOC仪测定（Chen et al.，2010）；土壤各形态有机磷按照 Tiessen et al.（2010）对Hedley磷素分级的改进方法连续提取，钼锑抗比色法测定；微生物生物量C、微生物生物量P采用氯仿熏蒸提取后测定（吴金水，2006）；土壤盐酸提取态Fe(Ⅱ)用0.5 mol·L-1稀盐酸提取后邻菲罗啉比色法测定（Yu et al.，2016）；酸性磷酸酶活性采用磷酸苯二钠-4-氨基安替比林比色法测定（Ge et al.，2018）；土壤和蚯蚓粪肥的pH、有机质、全氮、全磷、全钾、碱解氮、有效磷（Olsen-P）、速效钾均参照鲁如坤（2000）的分析方法测定。

1.4 数据分析

本次试验数据采用Microsoft Office Excel 2010进行统计，IBM SPSS statistics 20进行数据分析，Oringin 8.5.1作图。

2 结果与分析

2.1 蚯蚓粪肥对土壤微生物生物量碳、微生物生物量磷的影响

土壤微生物生物量碳变化如图 1a所示，各组小白菜根际土微生物生物量碳含量均极显著高于非根际土，收获期处理组根际土和非根际土微生物生物量碳相比对照组均有明显增加，其中在根际土中微生物生物量碳含量随施入的蚯蚓粪肥质量水平提高而上升，而随着蚯蚓粪肥施入量的继续增加，其含量趋于稳定，在非根际土中微生物生物量碳含量则随着蚯蚓粪肥施入量增加而保持缓慢上升。土壤微生物生物量磷变化如图1b，随着蚯蚓粪肥施入量的增加，根际土和非根际土微生物生物量磷含量均有所上升，其中以非根际土上升趋势最为明显。从根际土和非根际土之间比较来看，对照组小白菜根际土微生物生物量磷含量极显著高于非根际土，而在处理组中则相反。土壤微生物生物量碳磷比变化由图 1c可知，蚯蚓粪肥对小白菜根际土和非根际土微生物生物量碳磷比均有降低作用，对照组中根际土微生物生物量碳磷比高于非根际土的0.3倍，而在处理组中，根际土比非根际土高1.9－2.0倍。

表1 供试土壤和蚯蚓粪肥基本理化性质Table 1 Physical and chemical characteristics of the experimental soil and vermicompost

图1 不同蚯蚓粪肥添加水平土壤微生物生物量碳、微生物生物量磷和微生物生物量碳磷比的变化Fig. 1 Change of soil microbial biomass C, microbial biomass P and microbial biomass C/P among different vermicompost treatments

2.2 蚯蚓粪肥对非根际土酸性磷酸酶活性的影响

酸性磷酸酶活性变化如图2，在0－4 d随着培养时间的延长，对照组和处理组的酸性磷酸酶活性均呈明显上升趋势，14－35 d均趋于稳定。在整个培养过程处理组的酸性磷酸酶活性均极显著高于对照组，且随施入的蚯蚓粪肥质量增加而增加，但蚯蚓粪肥施入超过一定量时，酸性磷酸酶活性增加幅度有所降低。

图2 不同蚯蚓粪肥添加水平土壤酸性磷酸酶活性的变化Fig. 2 Change of soil acid phosphatase activity among different vermicompost treatments

2.3 蚯蚓粪肥处理下非根际土有效磷和各形态有机磷含量的变化

图3 培养期间不同蚯蚓粪肥处理水平土壤有效磷和各形态有机磷质量浓度变化情况Fig. 3 Change of soil available P and organophosphorus species activity contents among different vermicompost treatments during the period of culture

不同蚯蚓粪肥质量水平添加下非根际土有效磷含量变化情况如图 3a所示，在整个培养期间各组土壤有效磷含量均表现为0－7 d上升，7－35 d下降，且随着施入的蚯蚓粪肥质量水平的提高而增加，通过相关性分析发现在各处理组之间土壤有效磷含量差异极显著。NaHCO3-Po主要为吸附在土壤颗粒表面的活性有机磷和微生物生物量磷，易矿化为植物所吸收利用，其含量变化情况如图3b，在培养期间各处理组土壤 NaHCO3-Po含量变化趋势表现为0－7 d快速上升，7－21 d快速下降，21－35 d平缓下降，其中至培养末期A2、A3组下降幅度最大，分别下降 8.28 mg·kg-1和 6.23 mg·kg-1，而 CK和A1的NaHCO3-Po含量则在整个培养期间略微下降，总体上土壤NaHCO3-Po含量随施入的蚯蚓粪肥质量水平提高而上升。NaOH-Po主要指通过化学吸附而紧密结合于土壤铁铝氧化物表面的中稳定性有机磷，是有效磷的重要潜在供给源，其含量变化情况如图3c所示，从CK到A3 4个组土壤NaOH-Po含量在0－14 d微有上升，总体上随时间增长均呈缓慢下降趋势，其中对照组至培养末期仅下降0.49 mg·kg-1，处理组下降 17.24－31.69 mg·kg-1，以 A2和A3下降幅度最大。在整个培养期间处理组土壤NaOH-Po含量均极显著高于对照组，且随着施入的蚯蚓粪肥质量水平的提高而增大。C.HCl-Po为浓盐酸提取的有机磷，也可归为残渣态磷，属于稳定性磷，其在土壤中极难被植物所利用，其含量变化情况如图 3d，各组土壤 C.HCl-Po含量在培养期间变化趋势较一致，0－14 d总体上均呈快速上升趋势，14 d后趋于稳定，至培养末期，各处理组土壤C.HCl-Po含量上升幅度均明显高于对照组，其中A2 和 A3 分别上升 9.27 mg·kg-1和 9.14 mg·kg-1，差异性分析表明21－35 d A2和A3两组之间含量差异均不显著。

2.4 酸性磷酸酶活性、微生物生物量磷、有效磷以及各磷形态的相关性分析

各蚯蚓粪肥处理组土壤相关性分析结果表明：蚯蚓粪肥处理的土壤中酸性磷酸酶活性与NaOH-Po之间均存在显著负相关关系（表 2）；微生物生物量磷与NaOH-Po之间呈极显著负相关，在A2和A3水平下，微生物生物量磷还与NaHCO3-Po之间存在显著负相关关系，NaHCO3-Po与NaOH-Po存在显著正相关关系，稳定态有机磷 C.HCl-Po与NaOH-Po、NaHCO3-Po均呈显著负相关。

3 讨论

土壤微生物生物量是土壤中养分循环和转化的动力，同时也是植物有效养分的储备库，在土壤中微生物生物量对土壤环境因素变化极为敏感（樊晓刚等，2010），其中微生物生物量碳是土壤中有机碳最活跃的部分，因其在土壤中变化趋势与土壤有机质分解进程关系密切，可作为衡量土壤活性大小的重要指标，而微生物生物量磷则是植物有效磷的重要来源，微生物对磷素的固持可促进土壤中磷素的周转，提高土壤活性磷含量。本研究结果表明，施加蚯蚓粪肥对根际土壤和非根际土壤微生物生物量碳、微生物生物量磷均具有显著提高作用，其中大于 A2水平处理效果最好，这和白文娟等（2018）研究结果较一致，已有研究发现土壤中C/N比对微生物活性具有较大影响（Matschullat et al.，2018；王争妍等，2017），在充足的氮素供给下，蚯蚓粪肥添加对土壤有机碳尤其是水溶性有机碳含量的提高带动了微生物活性的提高，除此之外，蚯蚓粪肥优良的通气性和排水持水能力、较全面的营养物质以及良好孔隙结构等特点更为土壤中微生物营造了一个优质的生存环境（Abdissa et al.，2018），这些影响因素均有利于土壤微生物快速增殖，同时也是微生物生物量磷含量升高的主要原因。根际为根系-微生物-土壤相互作用的微型区域，因此根际土壤物理化学以及生物学性质与非根际土壤存在显著区别。根际土壤中微生物生长主要受到两方面的影响，一方面为植物在生长过程中通过根系分泌有机酸、糖类、生长素和酶等对微生物的活动的调节，另一方面根际微环境内土壤对微生物养分和能源物质的持续供给，这两方面导致植物根际土壤微生物生物量碳含量往往高于非根际土（赵辉等，2010），这和本研究结果相同。土壤微生物生物量磷为微生物固定在自身体内的磷，其含量既取决于微生物的数量也取决于微生物的种类（陈智裕等，2017）。本研究发现微生物生物量磷在对照组根际土中显著高于非根际土，而在各蚯蚓粪肥处

理组的根际土中则均显著低于非根际土，结合根际微生物量碳显著高于非根际土的实际情况，在不受植物根系调节下，蚯蚓粪肥能显著提高土壤解磷或贮磷微生物数量及比例，主要原因可能为植物根系对根际土壤游离磷素的吸收，导致根表面正磷酸根离子浓度下降而显著低于非根际土，从而影响解磷或贮磷微生物的生长以及对磷素的吸收，而非根际土微生物对磷的贮存同时也一定程度上促进了有效磷素向根系的质流和扩散。通过相关性分析发现，施加蚯蚓粪肥的非根际土壤中微生物生物量磷、酸性磷酸酶活性均与NaOH-Po之间呈极显著负相关关系，表明酸性磷酸酶对蚯蚓粪肥施加后土壤丰富的 NaOH-Po具有显著的水解作用，同时NaOH-Po也成为土壤解磷和贮磷微生物的主要磷源。而各组土壤微生物生物量磷与酸性磷酸酶活性呈极显著正相关关系，则表明了土壤中 NaOH-Po的活化不主要以微生物对碳的需求来驱动。酸性磷酸酶是一种主要由植物、细菌和真菌分泌的蛋白酶，可水解有机磷底物上的磷酸基团，生成可被植物和微生物直接吸收的磷酸根离子（Luo et al.，1994）。蚯蚓粪肥富含有机质的同时能够刺激微生物生长，其中铁还原菌为土壤中主要的一类能够异化还原Fe(Ⅲ)获得能量的微生物（Margalef et al.，2017），其对高价铁的还原以及有机物对铁的螯合均可促进 NaOH-Po的释放（令狐荣云等，2016），从而使其更易被矿化而为微生物所吸收。另有研究表明，Mg2+、Mn2+、部分腐殖酸类物质等可作为提高土壤酸性磷酸酶活性的激活剂（沈菊培，2005；房娜娜，2008）。除此之外，有机磷化学结构也对磷酸酶水解难易具有较大影响，蚯蚓粪肥提高了土壤 NaOH-Po中较易被酸性磷酸酶分解的组分也可能为促进 NaOH-Po矿化的重要原因。NaHCO3-Po为土壤中活性最高同时也是含量最低的有机磷，通过相关性分析发现，随着蚯蚓粪肥施加量的提高，NaHCO3-Po与微生物生物量磷、NaOH-Po之间的相关性均逐渐增强，在A2和A3处理中相关性均达显著水平，这可能主要与 NaOH-Po解吸附活化有关，蚯蚓粪肥施入土壤不断产生 NaHCO3-Po，NaHCO3-Po活性高的特点使其作为微生物能源物质的同时也作为微生物重要的碳源和磷源。C.HCl-Po在土壤中难以被活化，蚯蚓粪肥显著提高土壤活性磷含量的同时也促进了C.HCl-Po的蓄积，通过相关性分析发现对照组和各处理组 C.HCl-Po均与微生物生物量磷、Olsen-P极显著相关，其中在各处理组中 C.HCl-Po与微生物生物量磷的相关性均大于C.HCl-Po与Olsen-P之间的相关性，另外在A2、A3处理下C.HCl-Po均与NaHCO3-Po、NaOH-Po呈显著负相关，而 NaHCO3-Po包括土壤中微生物生物量磷，综合上述NaOH-P与微生物生物量磷之间关系的分析可知，蚯蚓粪肥作用下土壤中C.HCl-Po的合成主要与微生物生物量磷存在重要关系，这可能与土壤微生物生物量磷周转有关，已知核酸和磷脂为微生物体中最主要的含磷成分，在蚯蚓粪肥添加环境下，微生物死亡后核酸和磷脂被释放，随后发生的某些生物化学反应过程可能与 C.HCl-Po的合成有关。

表2 土壤酸性磷酸酶活性、微生物生物量磷、有效磷以及各形态磷素之间的相关关系Table 2 Correlation between acid phosphatase activity, microbial biomass P, available phosphorus and phosphorus forms

4 结论

（1）施加蚯蚓粪肥显著增加根际土和非根际土总微生物量以及微生物对磷的贮存量，其中非根际土中解磷或贮磷微生物量提升效果远高于根际土，在处理组中非根际土微生物生物量碳磷比均低于根际土1.9－2.0倍，在对照组中非根际土低于根际土0.3倍，而当蚯蚓粪肥施入量超过80 g·kg-1水平时，土壤微生物生物量磷以及微生物生物量碳均不再发生显著变化。

（2）蚯蚓粪肥处理的非根际土壤中微生物生物量磷、酸性磷酸酶活性均与NaOH-Po呈极显著负相关关系，而微生物生物量磷与酸性磷酸酶活性呈极显著正相关关系，表明蚯蚓粪肥对土壤酸性磷酸酶活性具有显著提高作用，有效促进NaOH-Po活化，同时蚯蚓粪肥处理的土壤中丰富的 NaOH-Po矿化促进了土壤微生物对磷的贮存。

（3）蚯蚓粪肥在加速土壤 NaHCO3-Po和NaOH-Po矿化的同时也促进了C.HCl-Po的合成，其中在各处理组中 C.HCl-Po均与微生物生物量磷呈极显著正相关，80、120 g·kg-1处理下与 NaHCO3-Po、NaOH-Po均呈显著负相关，表明蚯蚓粪施入处理下C.HCl-Po的合成主要与微生物生物量磷显著相关。