针刺对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠JAK2、P-STAT3、IL-17表达的影响

李 琪，赵东杰，王玉华，董 莎，常 磊，张 鹏，宋方亚，辛随成

(北京中医药大学，北京 100029)

多发性硬化(Multiple sclerosis，MS)是中枢神经系统炎性脱髓鞘为主要病理特征的自身免疫性疾病，好发于中青年，男女比例约为1∶2，最常累及脑室周围白质、视神经、脊髓及脑干等部位，常见症状有肢体瘫痪、视力障碍、共济失调、言语困难及感觉异常等，且易反复发作，遗留神经系统症状或体征，最终造成神经功能不可逆缺损，严重影响工作与生活。实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是目前国际上研究MS的经典动物模型[1]。研究发现，在MS/EAE中被激活的免疫细胞产生大量的炎性细胞因子(如IL-17)进入血-脑脊液屏障，促进疾病发展[2]。JAK/STAT信号通路调节多种细胞因子的生物学活性，是主要介导中枢神经系统炎性免疫反应的关键信号传导通路，为调控免疫应答所必需[3-4]。

目前,西医无特异性的有效治疗手段，国内外的一线治疗方案均采取激素治疗，但其疗效和预后较差，且不良反应明显(肥胖，电解质紊乱，血糖、血压、血脂异常，上消化道出血，骨质疏松及股骨头坏死等)、价格昂贵，不适合长期服用[5]。针刺作为一种非药物医疗手段在疾病治疗中被频繁提及，MS患者的针刺使用率有7.2%～21%不等，不少报道显示，针刺能改善MS残疾程度、控制复发及对症治疗[6-8]。

本研究通过测定C57BL/6小鼠EAE的体质量、神经功能缺损评分、脑组织JAK2、P-STAT3表达及血清IL-17表达，探讨针刺干预C57BL/6小鼠EAE的疗效及其对JAK2/STAT3信号通路的调节作用，为临床治疗MS提供新的思路及理论支持。

1 材料

1.1 实验动物和分组

40只SPF级雌性8～10周龄的C57BL/6小鼠，购自北京维通利华实验动物有限公司，体质量18～20 g，动物批号：SCXK(京)20160006。实验动物分组：将40只实验动物称重编号后，按随机数字表分成空白对照组、EAE模型组、激素治疗组、针刺治疗组，每组10只。经中国中医科学院中药研究所动物实验伦理委员会批准。饲养于中国中医科学院中药研究所动物实验中心屏障环境动物实验室，室温20～24℃，相对湿度40%～60%，12 h明暗周期。适应性喂养1周后进入实验。

1.2 主要仪器和试剂

髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein35-55，MOG35-55，纯度：98.55%，购自北京百诺威生物有限公司，批号：NJP30376-180111)；百日咳毒素 (Pertussis toxin，PTX，购自北京百诺威生物有限公司，批号：181236A1)；完全弗氏佐剂(CFA，其中结核杆菌H37Ra终浓度为4 mg/mL，购自北京华菁科技有限公司，批号：170597)；JAK2抗体(产自abcam公司，批号：ab39636)；P-STAT3抗体(产自abcam公司，批号：ab76315)；小鼠IL-17A/F酶联试剂盒(产自联科生物，批号：EK21772)；醋酸泼尼松片(5 mg/片，产自上海上药信谊药厂有限公司，批号：017171002)；针刺用具(中研太和牌无菌针刺针，规格:0.25 mm×25 mm)。

2 方法

2.1 动物模型制备

EAE模型建立：将抗原MOG35-55用生理盐水稀释成10 mg/mL，并按1∶1等体积加入完全弗氏佐剂(其中结核杆菌H37Ra终浓度为4 mg/mL)混合制作乳化剂。乳化后以每只0.1 mL于小鼠脊柱两侧分4点进行皮下注射，免疫当天(即第0 h)及第2天(即48 h)分两次腹腔注射0.5 mL PTX(500 ng/只)，建立小鼠EAE模型。上述免疫过程在乙醚麻醉及充分固定下进行。模型鉴定：从免疫第0天开始直到免疫第28天实验结束取材为止，每天在相同的时间点(下午14:00—16:00)观察小鼠的行为学变化(如毛色、行为及饮食)，隔天称量记录小鼠的体重，记录神经功能评分，标准参考国际通用5分评分制[9]：0分：无症状；1分：尾张力消失，轻度步态笨拙；2分：一侧后肢无力，被动翻身后恢复；3分：双后肢瘫痪，刺激后可挪动；4分：双后肢瘫痪伴有前肢瘫痪；5分：濒死状态或死亡。其中，症状在两者之间者，以±0.5分计算。

2.2 干预方法

针刺治疗组免疫后第14天开始，每天同一时间(上午9:00)进行针刺治疗，每次留针15 min，至第28天取材，共15次。针刺方法：在不麻醉的情况下，将实验小鼠固定于自制束鼠器上，常规消毒，选用规格为0.25 mm×25 mm毫针针刺小鼠“大椎穴”(第7颈椎与第1胸椎之间，背部正中，直刺2～3 mm)、双侧“肾俞穴”(第2腰椎下两旁，向脊柱方向斜刺2～3 mm)、双侧“足三里”(膝关节下外侧，腓骨小头下3.5 mm处直刺2～3 mm)。每次均为同一人针刺，准确取穴，严格按照要求深度针刺。激素治疗组免疫后第14天开始，每天同一时间(上午9:00)，对小鼠进行激素冲击疗法，每次醋酸泼尼松混悬液(0.6 mg/mL，醋酸泼尼松片用生理盐水配制成要求的浓度)灌胃，0.1 mL/10 g/天，连续治疗15天。空白对照组和EAE模型组每天抓取1次。

2.3 检测方法

脑病理组织学检查：实验小鼠于免疫后第28天，用水合氯醛麻醉至小鼠软瘫，然后剪开胸腔，充分暴露心脏，用注射针头快速左心室内插管，用动脉夹将针头固定好，剪开右心耳，以0.9%生理盐水冲洗，待肝脏变白再用4%多聚甲醛缓冲液灌注固定，进行心脏灌流，断头取全脑浸于4℃的4%多聚甲醛中固定24 h，从大脑冠状位由视交叉向尾端取3～4 mm组织块，石蜡包埋。石蜡切片机连续冠状切片，制备成5 μm的切片，进行LFB髓鞘染色。

检测脑组织中JAK2、P-STAT3免疫组化表达：取以上切片作JAK2、P-STAT3免疫组化染色，操作按试剂盒说明书进行，阳性表达为细胞染成黄色或棕黄色。每只小鼠随机选择1张切片，并在显微镜下选择侧脑室周围的3个随机视野(HP，400×)，采用Image-proplus 6.0软件，分别计算各个部位的阳性表达的积分光密度值(IOD/HP)。

检测血清ELISA的IL-17表达：取小鼠各组冻存血清，通过ELISA双抗体夹心法检测细胞因子IL-17水平，具体操作按照联科生物公司ELISA试剂盒所提供的实验步骤进行，在酶标仪(ELx800，BioTek)读取数据。

2.4 统计方法

3 结果

3.1 各组小鼠体质量和神经功能学评分比较

图1 各组小鼠免疫第0天至28天体质量变化

图2 各组小鼠免疫第0天至28天神经功能缺损评分

免疫后的小鼠发病率为100%(30/30)。小鼠免疫后逐渐出现精神萎靡、食欲下降、体重减轻，于免疫10天逐渐出现临床症状，如尾部无力、肢体瘫痪、二便失禁和偶有背部皮肤破溃等，逐渐加重，空白对照组无小鼠发病，体重持续增长，活动度正常，各组小鼠体质量、神经功能评分和状态见图1～3。免疫0天，各组小鼠体质量和神经功能缺损评分无统计学差异(P>0.05)。免疫14天，与空白对照组相比，EAE模型组、激素治疗组和针刺治疗组的小鼠体重均持续下降(P<0.01),神经功能缺损评分均显著增加(P<0.01)。免疫20天，与EAE模型组相比，激素治疗组、针刺治疗组的小鼠体质量均升高(P<0.01)、神经功能缺损评分均显著降低(P<0.01)；与激素治疗组相比，针刺治疗组的小鼠体质量无统计学差异(P>0.05),神经功能缺损评分升高(P<0.01)。免疫28天，与EAE模型组相比，激素治疗组、针刺治疗组的小鼠体质量均升高(P<0.01),神经功能缺损评分均降低(P<0.05)；两治疗组相比，针刺治疗组小鼠的体质量较低(P<0.05),神经功能缺损评分无统计学差异(P>0.05)。见表1～2。

小鼠状态观察示空白对照组小鼠的神经功能无异常，评分为0分;EAE模型组小鼠的双后肢瘫痪，刺激后可挪动，神经功能异常，评分为3分；激素治疗组小鼠的尾部张力消失，步态不稳，神经功能异常，评分为1分；针刺治疗组小鼠的一侧后肢无力，步态蹒跚，神经功能异常，评分为2分。见封三彩图3。

表1 各组小鼠体质量情况比较

注：与空白对照组比较，★★P<0.01；与EAE模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与激素治疗组比较，＊P<0.05，＊＊P<0.01。

表2 各组小鼠神经功能评分情况比较

注：与空白对照组比较，★★P<0.01；与EAE模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与激素治疗组比较，＊P<0.05，＊＊P<0.01。

3.2 各组小鼠脑组织病学检查结果比较

空白对照组小鼠的脑组织无异常,未见脱髓鞘。EAE模型组、激素治疗组和针刺治疗组小鼠的脑组织可见大小不等的片状髓鞘脱失区，呈空泡样改变，以侧脑室周围最明显。其中EAE模型组髓鞘脱失最明显，有大量空泡样改变；激素治疗组、针刺治疗组较EAE模型组髓鞘脱失程度有所减轻，有少量空泡样改变。见封三彩图4。

3.3 各组小鼠脑组织JAK2、P-STAT3免疫组化表达

与空白对照组相比，EAE模型组、激素治疗组和针刺治疗组的小鼠脑组织JAK2、P-STAT3的表达水平有显著差异(P<0.01)；与EAE模型组相比，激素治疗组和针刺治疗组的小鼠脑组织JAK2、P-STAT3的表达水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)；针刺治疗组与激素治疗组相比，小鼠脑组织中JAK2、P-STAT3的表达水平无统计学差异(P>0.05)。见表3。

表3 各组小鼠脑组织中免疫组化JAK2、P-STAT3平均积分光密度IOD值

注：与空白对照组比较，★★P<0.01；与EAE模型组比较，△△P<0.01。

脑组织JAK2免疫组化阳性表达为细胞呈黄色。空白对照组JAK2阳性细胞着色浅，呈淡黄色，数量少；EAE模型组着色深，呈褐黄色，数量多；激素治疗组着色较深，呈棕黄色，数量较少，介于EAE模型组和空白对照组之间；针刺治疗组着色较深，呈棕黄色，数量较少，介于EAE模型组和空白对照组之间。见封三彩图5。

脑组织P-STAT3免疫组化阳性表达为细胞呈黄色。空白对照组P-STAT3阳性细胞着色浅，呈淡黄色，数量少；EAE模型组着色深，呈棕黄色，数量多；激素治疗组着色较深，呈黄色，数量较少，介于EAE模型组和空白对照组之间；针刺治疗组着色较深，呈黄色，数量较少，介于EAE模型组和空白对照组之间。见封三彩图6。

3.4 各组小鼠血清ELISA的IL-17表达比较

与空白对照组相比，EAE模型组、激素治疗组和针刺治疗组的小鼠血清ELISA的IL-17表达水平有显著差异(P<0.01)；与EAE模型组相比，激素治疗组、针刺治疗组的小鼠血清ELISA的IL-17表达水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)；针刺治疗组和激素治疗组相比，小鼠血清ELISA的IL-17表达水平有统计学差异(P<0.05)。见表4。

表4 各组小鼠血清中IL-17含量

注：与空白对照组比较，★★P<0.01；与EAE模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与激素治疗组比较，＊P<0.05，＊＊P<0.01。

4 讨论

MS是中枢神经系统炎性脱髓鞘为主要病理特征的自身免疫性疾病，研究表明髓鞘脱失与淋巴细胞(CD4+)介导的细胞免疫有关[10]。在细胞因子TGF-β和IL-6的共同诱导下，初始CD4+T淋巴细胞在JAK2/STAT3调控下，可分化为Th17细胞，并与IL-17基因结合，增强其转录，进一步分泌致炎因子IL-17，诱导严重的自身免疫反应，如中枢神经系统炎性细胞浸润、髓鞘脱失、轴索损伤或胶质细胞增生，能导致神经元细胞不可逆的变性死亡[11-12]。JAK/STAT是一条涉及多种细胞因子和生长因子的细胞内信号传导通路，受多种细胞因子激活，具有信号传导和转录活化相应靶基因的双重作用，对维持机体正常状态、改善神经退行性变有重要作用[13]。JAK是STAT信号转导通路的上游激酶，被激活的JAK可诱导细胞胞浆中STAT单体分子磷酸化(P-STAT)形成STAT二聚体，然后向细胞核内转移并调控相应基因的表达[14]。研究表明，在MS/EAE中，JAK/STAT信号通路失调可导致自身免疫性疾病，其中STAT1和STAT3是MS患者的易感基因[3-4]。以MOG35-55多肽加CFA作为抗原，PTX增强抗原，免疫C57BL/6小鼠制备MS的EAE动物模型，所建模型稳定，发病率可高达100%。

中医无“多发性硬化”病名，根据临床表现常将其归属于“痿症”范畴，以肾虚为主[15]。《素问·痿论篇》曰:“有所远行劳倦，逢大热而渴，渴则阳气内伐，内伐则热舍于肾，肾者水脏也，今水不胜火，则骨枯而髓虚，故足不任身，发为骨痿”,肾主骨生髓，肾衰则形体疲极。这与MS患者最常见的肢体迟缓无力、萎缩废用等临床表现十分切合。背俞穴属于足太阳膀胱经，是五脏六腑之气输注之处，脏腑气机条达则气血运行正常，无痿痹之患。故针刺肾俞穴能补肾气、益阴阳、强腰健骨、补先天之本。《难经·二十八难》曰:“督脉者，起于下极之俞，并于脊里，上至风府，入属脑”。督脉“总督诸阳”，是“阳脉之海”，还络一身之阴气，五脏六腑之气的输注、功能活动与督脉密切相关。故针刺大椎穴，通调督脉，统理十二经脉之阳气，使上下贯通，阳气通达，加强脑、脊髓和肾的密切关系，是临床常用穴位。《素问·痿论篇》曰:“阳明者,五脏六腑之海,主润宗筋,宗筋主束骨而利机关也……故阳明虚,则宗筋纵,带脉不引,故足痿不用也”。阳明经为多气多血之经,“治痿独取阳明”，故针刺阳明经穴足三里,气血生化有源,经脉得养,关节得利而活动自如。

针刺作为疾病治疗中一种重要的非药物医疗手段，目前有7.2%～21%的MS患者应用，而且不少临床报道显示，针刺能改善MS残疾程度、控制疾病复发及对症治疗(痛性痉挛、慢性疼痛、感觉异常、抑郁焦虑、乏力、疲劳、震颤、膀胱直肠功能障碍及性功能障碍、认知障碍等)[6-8]。笔者团队具有针刺干预EAE的前期动物实验基础，且导师有30多年针刺治疗MS的临床经验，疗效可观。MS属于中枢神经系统自身免疫性疾病，研究发现，针刺可有效调节内分泌激素、细胞因子等多个环节促进MS患者细胞免疫与体液免疫系统恢复功能及维持平衡。针刺穴位后，局部神经和相应感受器可将刺激信号传递到中枢神经系统，引起中枢释放递质、分泌细胞因子等免疫反应，可实现人体免疫系统的调节功能[16]。在MS/EAE中，实验研究表明，通过JAK2/STAT3调控，CD4+T淋巴细胞分化为Th17细胞，分泌致炎因子IL-17，针刺能够降低EAE炎性细胞浸润，下调CD4+T细胞表达，改善神经功能评分[17-18]，降低Th17细胞的表达[19-21]，减轻其脑组织的病理改变，有效地抑制小鼠促炎性细胞因子IL-17的分泌[22]。针刺调节JAK/STAT通路的研究主要集中于类风湿性关节炎、脑缺血和膝骨关节炎等免疫炎性疾病，均提示针刺可调节JAK/STAT通路，具有抗炎、免疫调节作用。研究表明，针刺能改善脑缺血后神经功能缺损评分，下调JAK2 mRNA的表达，提示针刺能阻断JAK2在JAK/STAT途径中诱导的信号转导通路的异常激活[23-25]。然而，针刺是否对EAE小鼠JAK2/STAT3信号通路有调节作用尚不清楚。

本研究结果显示，与空白对照组比较，EAE模型组小鼠体质量降低、神经功能缺损评分显著升高、脑组织病理脱髓鞘明显、脑组织JAK2、P-STAT3表达显著升高，血清IL-17表达显著增加，提示EAE小鼠JAK2/STAT3信号通路可能被过度活化而导致中枢神经系统免疫炎性反应。与EAE模型组比较，经针刺或者激素治疗后，神经功能缺损评分，脑组织病理脱髓鞘程度，脑组织JAK2、P-STAT3表达，血清IL-17表达均显著降低，提示针刺和激素治疗对EAE小鼠均有治疗作用，能改善神经功能、病理脱髓鞘程度，降低JAK2、P-STAT3及IL-17表达，抑制免疫炎性反应。与激素治疗组相比，针刺治疗组小鼠体质量较低，神经功能缺损评分较高，病理脱髓鞘程度较重，JAK2、P-STAT3和IL-17表达较高，针刺治疗对EAE小鼠疗效显著，但疗效未及激素治疗，可作为一种辅助治疗，对MS的治疗具有潜在的价值。

综上所述，针刺“大椎穴”“肾俞穴”“足三里”可能是一种治疗MS安全、有效、简便、经济的疗法，其治疗机制可能与抑制JAK2/STAT3信号通路的表达、降低IL-17表达、改善神经炎症和脱髓鞘程度有关。其具体的免疫调节机制尚不确定，更多深入、全面的机制探索需在今后的研究中进一步探讨。