欣力康胶囊对Lewis肺癌模型小鼠生存期的影响及作用机制初探

王 青 ，阙祖俊，田建辉

目前肺癌已成为发病率和死亡率增长最快的恶性肿瘤，且肺癌转移是导致死亡的主要原因。欣力康胶囊是中药复方制剂，具有补气养血，化瘀解毒等功效，可用于癌症放化疗的辅助治疗[1-2]，增强放化疗的疗效[3]，提高生活质量，预防肿瘤复发与转移[4]。前期体外研究结果表明，欣力康胶囊对人肺癌细胞，鳞癌细胞及乳腺癌细胞等均有一定程度的抑制作用[5-6]。但是，欣力康胶囊在体内对肺癌的药效并不清楚，而且缺乏作用机制的研究。STAT3与NFκB信号通路能够影响肿瘤的发生发展，迁移侵袭及分化[7]，并且与机体免疫及炎症均有密切关系[8-9]。本研究通过尾静脉注射肺癌细胞建立了肺转移模型小鼠，观察了不同浓度的欣力康胶囊对肺转移模型小鼠生存期和生存状态的影响，同时研究了欣力康对STAT3与NFκB信号通路的作用，以期为欣力康预防肺癌复发和转移的临床用药提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 小鼠（C57BL/6小鼠，6～7周龄，体质量约20 g）；注射细胞（对数生长期的LLC-luc细胞）；注射器；生理盐水；欣力康胶囊。

1.2 造模 采用实验性肺转移模型进行药效评价[10-11]。取对数生长期的LLC-luc细胞，将细胞消化后用生理盐水洗涤一次，将细胞浓度调整为1×107个/mL。将饲养的C57BL/6小鼠分为3组，每组10只。每只小鼠尾静脉注射上述细胞悬液0.1 mL，造模后自由饮食与进水。

1.3 药物溶解及配制 取欣力康胶囊（0.45 g/粒）20粒，将粉末倒出，称取8.0 g，置于20 mL定量容量瓶中。加入10 mL水，超声10 min溶解，定容，配制成0.40 g/mL的样品溶液。取3 mL继续稀释5倍，配制成0.08 g/mL的样品溶液。

1.4 给药 按照动物-人体计量换算公式，人：0.45 g/粒×5粒×3次=6.75 g/d，计算小鼠每日剂量：6.75 g/70 kg×9.1×20 g/只=17.5 mg/只。将小鼠分为3组，分组给药，造模后第2 d开始给药，直至小鼠死亡。生理盐水组：灌胃生理盐水，0.22 mL每只，1次/d；低浓度欣力康组（临床剂量）：灌胃低浓度欣力康溶液（0.08 g/mL），0.22 mL每只，1次/d；高浓度欣力康组（5倍临床剂量）：灌胃高浓度欣力康溶液（0.40 g/mL），0.22 mL每只，1次 /d。

1.5 Luciferase活性测定 构建分别转染了STAT3-luciferase报告基因质粒和转染了NFκB-luciferase报告基因质粒的肿瘤细胞，体外培养。细胞生长至对数生长期后，收集细胞，1000 r/min离心5 min。弃上清，适量培养基悬浮，调整细胞浓度至3×105/mL。将细胞悬液接种到96孔细胞培养板中，每孔100 μL，放置细胞培养箱（37℃，5%CO2）中培养48 h。吸去培养基，每孔加入100 μL稀释好的药物（欣力康胶囊0.1、0.5、1、5、10 mg/mL），每药设2个复孔。设4个阳性对照孔，两个阴性对照孔，培养1 h。每孔加入激动剂Interleukin-6/Tumor necrosis factor-α （IL-6/TNF-α）11 μL，培养5.5 h。弃去培养基，每孔加入1×细胞裂解液30 μL，震荡使细胞充分裂解。取20 μL到酶标板中，加入30 μL荧光素酶底物。酶标仪检测，计算各浓度下的抑制率。

1.6 统计方法 通过Kaplan-Meier方法计算存活分析，并通过log-rank检验进行比较，P＜0.05代表具有显著性差异。所有数据用SPSS19.0软件进行统计分析, 均数比较采用One-way ANOVA方差分析，P＜0.05代表具有显著性差异，Post test检测采用Bonfemoni法分析，计算各组间统计学差异性。

2 结果

2.1 小鼠肺癌肺转移模型构建成功 尾静脉注射LLC-luc细胞的C57BL/6小鼠，造模2周后进行解剖。结果显示，LLC-luc细胞只转移到了肺部，肾脏及其他部位并无发生转移（图1）。说明肺癌肺转移模型构建成功。

图1 尾静脉注射肺癌肺转移造模结果

2.2 欣力康胶囊改善模型小鼠生存状态 生理盐水组小鼠普遍表现为精神萎靡、嗜睡、毛色无光泽、基本无活动，且极少进食与饮水；低浓度欣力康组小鼠表现与生理盐水组相似；高浓度欣力康组小鼠精神状态明显改善、毛色相对光泽、活动性增强，且进食与饮水量明显增加。说明欣力康胶囊能够明显改善小鼠生存状态。

2.3 欣力康胶囊延长模型小鼠生存期 分别计算3组小鼠的中位生存时间，生理盐水组小鼠中位生存时间为17 d，低浓度欣力康组为17.5 d，高浓度欣力康组为21 d（见表1）。高浓度欣力康组小鼠生存时间明显长于生理盐水组（P＜0.05，图2）。表明欣力康胶囊能够延长肺癌肺转移模型小鼠的生存期。

表1 各组小鼠生存时间的比较（）

表1 各组小鼠生存时间的比较（）

注：a:与生理盐水组比较，P＜0.05；b:与低浓度欣力康组比较，P＜0.05

组别 n 中位生存时间（d）生理盐水组 10 17±3.83低浓度欣力康组 10 17.5±2.09高浓度欣力康组 10 21±4.18a、b

图2 欣力康延长肺癌肺转移模型小鼠的生存期

2.4 欣力康胶囊抑制肿瘤相关STAT3和NFκB信号通路激活 体外Luciferase活性测定结果显示，欣力康胶囊能够呈浓度依赖性的抑制肿瘤相关STAT3和NFκB通路激活，且具有显著性统计学差异(P＜0.05)（图3)。表明欣力康胶囊改善小鼠生存状态，延长模型小鼠生存期的作用机制与欣力康抑制STAT3和NFκB信号通路有关。

3 讨论

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，近年来发病率和病死率呈上升趋势，已居于各种恶性肿瘤的首位。肺癌起病隐匿，早期常被漏诊，临床上很多肺癌患者就诊时已属中晚期，失去了早期手术切除的最佳机会。中晚期肺癌多以放化疗为主，部分患者也会使用靶向药物治疗。而放化疗在杀灭恶性肿瘤细胞的同时会有各种毒性反应，靶向药物价格昂贵，且瘤细胞易对其产生耐药性[12]。随着现代医学的发展，人们逐渐认识到恶性肿瘤治疗的目的不仅仅是消除肿瘤细胞、缩小肿瘤、更重要的是提高患者的生存质量，延长生存期[13-14]。中医药在改善临床症状，提高患者生存质量方面具有独特优势，应用中医药治疗中晚期肺癌已经得到了广泛认同。

图3 欣力康抑制STAT3和NFκB信号通路激活

肺癌于中医的病机有虚实而分，全身多“虚”，局部属“实”，属本虚标实之病，即正气不足为肺癌发生发展的根本原因，邪毒则是其致病重要的条件[15]。因此，扶正祛邪为中晚期肺癌的基本治疗原则。研究显示，扶正祛邪类中药如扶正消癌方[16]、参芪扶正注射液[17]、抗癌扶正协定方[18]等，在小鼠肺癌模型中均显示出较好的效果。欣力康胶囊是由半枝莲、黄芪、当归、龙葵、郁金、红参、蛇莓、雪莲花、轮环藤根和丹参十味中药组成的苗族经验方，从组方上分析，以扶正成分为主，其中黄芪、当归、郁金、红参、雪莲花、丹参均为扶正类药材，具有补气养血的功效。同时又兼具祛邪成分，像半枝莲，龙葵是经典的抗癌药，两者和蛇莓，轮环藤根均具有化瘀解毒的功效。因此，欣力康作为扶正祛邪类中药，针对中晚期肺癌的病因病机属于对症治疗。

为了研究欣力康胶囊对肺癌在体内的药效，我们构建了肺癌肺转移模型小鼠，观察了欣力康胶囊对肺癌模型小鼠的影响。研究结果表明，适当浓度的欣力康胶囊能够明显改善模型小鼠的精神状态，提高其活动性，增加摄食和饮水量，明显改善小鼠的生存状态。同时可延长肺转移模型小鼠的生存期。提示我们在临床上对于一些年迈体弱，或由于种种原因不适合手术治疗而放化疗效果不佳的中晚期癌症患者，可选用欣力康辅助治疗，延长生存期，减轻临床症状，以改善生活质量。

为了更进一步研究欣力康胶囊的作用机制，我们体外分别构建了转染了STAT3-luciferase报告基因质粒和转染了NFκB-luciferase报告基因质粒的肿瘤细胞。Luciferase活性测定结果显示，欣力康胶囊能够呈浓度依赖性的抑制STAT3和NFκB通路激活，且在低浓度时仍有抑制作用。STAT3与NFκB信号通路是经典的与肿瘤相关的信号通路，因此我们推测，欣力康胶囊改善小鼠生存状态，延长模型小鼠生存期的潜在作用机制与欣力康抑制STAT3和NFκB信号通路激活有关。

本研究通过动物实验，揭示了欣力康胶囊对肺癌的体内药效。进一步通过构建稳转细胞株实验进行了相关作用机制的初步分析，为欣力康在临床上用于治疗中晚期肺癌患者提供了重要依据。但是，欣力康是否通过其他途径影响肺癌肺转移模型小鼠肿瘤转移，增强免疫力，抑制肿瘤生长，亦或其他作用，目前尚不完全清楚。我们将进行更深入的研究，为欣力康的临床用药提供更多依据。