Livin CMTM3与胃癌的相关性研究

(山东医学高等专科学校，山东 临沂 276002)

胃癌是中国第二大常见癌症，早期诊出率低，中晚期患者治疗手段效果有限，其发病机制尚不清楚。在分子水平上探讨胃癌的发病机制有助于提供其早期发现和治疗的新途径，也有助于探寻胃癌的预后因素，从而改善胃癌的治疗效果。因此，对胃癌的发病相关基因进行深入研究具有重要意义。Livin基因在大多数正常成人组织中不表达，而在一些肿瘤组织细胞中高表达，常引起组织细胞凋亡受阻，与肿瘤的发生密切相关[1]。CMTM是一个新基因家族，主要成员有CMTM1-8和CKLF，CMTM3是新的潜在抑癌基因，其在人正常组织中广谱表达，而在多种肿瘤来源的细胞系中表达下调或缺失[2]。本项目将分析Livin、CMTM3基因在胃癌中的表达与患者病情的相关性，研究Livin、CMTM3基因对胃癌细胞的作用及机制，为胃癌的早期判断、个体化治疗及预后判断提供新的理论依据。

1 资料与方法

1.1临床资料 选择2017年3月-2018年2月本校附属医院收治的胃癌患者35例作为观察组，所有患者均经临床和实验室检查确诊，其中男21例，女14例；年龄≥45岁者24人，年龄<45岁者11人。另选来本院就诊的胃炎患者28例作为对照组，其中男15例，女13例；年龄22～53岁，平均(32.8±8.9)岁。两组的年龄及性别比较均无显著性差异(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1标本采集 两组均采集静脉血约3 ml，注入EDTA-K2试管中，立即混匀6次，然后用外周血淋巴细胞分离液分离单个核细胞(PBMC)，取约7×106个细胞，用PBS缓冲液清洗2遍，-20℃保存，以备后续实验使用。

1.2.2细胞总RNA抽提 采用Invitrogen公司试剂盒提取RNA，严格按说明书进行预实验和实验操作。用紫外线分光光度计测定RNA纯度，A260/A280 =1.8～2.0视为RNA浓度较高，蛋白质杂质较少，再用于下一步实验。采用浓度为15 g/L的琼脂糖进行凝胶电泳，最终见到3条清晰核酸条带，说明RNA的提取合适。

1.2.3cDNA的合成 取RNA样品5 g，OLigo (dT)primer(0.5 g/L)1μL，加DEPC处理水至12 μl，于70℃水浴5 min。冰上骤冷后，加5×逆转录缓冲液6 μl，RNA 酶抑制剂20 U， dNTPs 3 μl，40℃水浴5 min后，置于冰上，加入RevertAid M-MuLV逆转录酶200 U，反应体系25 μl，42℃反应70 min，最后70℃下放置12 min终止反应。

1.2.4引物设计 实验中本引物根据GenBank提供的Livin mRNA序列(AF3l 1378)，由上海生工生物公司进行合成。具体引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

1.2.5PCR反应体系 25 μl反应体系包括逆转录产物5 μl，20 μmoL/L上、下游引物各1 μl，2.5 mmoL/LdNTP 5 μl，10×PCR反应缓冲液5 μl，25 mmol/LMgCl2 4 μl，TaqDNA聚合酶2 U，其余以DEPC水补至25 μl。Livin的扩增条件为：94℃预变性5 min，1个循环；94℃变性42 s，62℃复性40 s，72℃延伸55 s，35个循环；最后72℃延伸5 min。CMTM3扩增条件为：94℃预变性5 min，1个循环；94℃变性46 s，60℃复性45 s，72℃延伸50 s，32个循环；最后72℃延伸10 min。

1.2.6PCR产物分析 采用2%琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行电泳(75V，45 rain)分析，在紫外透射仪下观察。

2 结果

2.1基因表达 Livin基因：观察组阳性率为51.4%(18/35)，对照组为14.3%(4/28)，二者比较有统计学意义(χ2=7.79，P<0.01)。CMTM3基因：观察组阳性率为25.7%(9/35)，对照组为78.6%(22/28)，观察组基因表达低于对照组(χ2=15.34，P<0.01)。

2.2观察组Livin及CMTM3与临床指标的关系 Livin、CMTM3表达在年龄、性别方面均无显著差异，在组织分化程度方面均有显著差异；另外，Livin在淋巴转移方面无显著差异，而CMTM3则有显著差异。见表2。

2.3观察组Livin及CMTM3表达相关性分析 二者表达无相关性(r=0.049，P=0.782)。见表3。

3 讨论

凋亡抑制蛋白家族是一类具有抗凋亡活性的蛋白质，Livin是此家族新发现的家族成员，对抑制细胞凋亡具有极强的作用，被认为是抗凋亡作用最强的因子之一[3-4]。研究显示，Livin在大多数正常成人终末分化组织中低表达或不表达， 而在多数实体肿瘤中呈现较高的表达水平，主要通过抑制胱天蛋白酶-3/-7/-9(Caspase-3/-7/-9)的活性来阻断细胞的凋亡过程，影响肿瘤的发生及进展，可能成为肿瘤临床治疗新的切入点[5]。还有观点认为，Livin可通过抑制TNF-α介导的细胞凋亡作用而发挥抗凋亡作用。侯毅鞠等发现胃癌患者组织中Livin 增高，常与肿瘤分化程度、肿瘤浸润度及是否发生淋巴转移组密切相关[6]。在乳腺癌、膀胱癌等患者也存在Livin表达增高的情况[7]。本研究证实，胃癌组织中的Livin表达明显升高，而且肿瘤分化程度较差的胃癌组织中Livin表达要比分化较好的更高；本实验还发现胃癌组织不论是否发生淋巴结转移，Livin表达无显著差异。

表2 观察组Livin及CMTM3表达与临床指标的关系

表3 胃癌组织Livin与CMTM3表达相关性分析

2003年，北京大学人类疾病基因研究中心在世界范围内首先发现了CMTM3，其在结构上介于趋化因子与4次跨膜蛋白，并含有1个MARVEL结构域，其参与了人类免疫系统和男性生殖系统等过程，它还参与了肿瘤等疾病的发生、发展和转移。CMTM3基因则位于人16号染色体长臂上(16q22.1)，目前有研究表明其在很多恶性肿瘤中都存在表达缺失，如前列腺癌、口腔鳞状细胞癌和睾丸癌[8-9]。正常组织中CMTM3表达丰富，可以Caspase-3，诱导细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的增殖与迁移[2-3]，而在肿瘤组织中，启动子区CpG甲基化将导致CMTM3基因沉默，导致基因功能丧失，细胞发生恶变，最终导致肿瘤发生。本实验发现胃癌组织中的CMTM3呈低表达状态，而且肿瘤分化程度较差的胃癌组织和已经发生淋巴转移的胃癌组织中CMTM3表达要比分化较好的更低，说明CMTM3与肿瘤组织分化程度和淋巴转移密切相关，可作为患者预后判断的指标。

由此可见，对胃癌高危患者早期监测Livin和CMTM3表达情况，可提高胃癌的早期检出率，为胃癌的早期预防、分化程度、预后评价及临床治疗提供了敏感的实验室标志物，同时也为胃癌治疗药物研究提供了新的途径。