c-di-GMP在低温好氧颗粒污泥形成过程中的作用

支丽玲,王玉莹,马鑫欣,衣雪松,王 硕,李 激*



c-di-GMP在低温好氧颗粒污泥形成过程中的作用

支丽玲1,2,王玉莹1,2,马鑫欣1,2,衣雪松3,王 硕1,2,李 激1,2*

(1.江南大学环境与土木工程学院,江苏 无锡 214122；2.江南大学江苏省高校水处理技术与材料协同创新中心,江苏 苏州 215009；3.海南大学环境与生态学院,海南 海口 570228)

在低温条件下运行好氧颗粒污泥反应器,絮状污泥颗粒化过程中信号分子可通过传导作用引起各层物质之间的组分变化,通过研究胞外聚合物及污泥相关疏水性的变化规律,并观察此过程中微生物菌群的群落演替特点,揭示环二鸟苷酸(c-di-GMP)在低温好氧颗粒污泥形成过程中的变化规律与影响作用.结果表明:接种污泥在颗粒化过程中,胞外聚合物含量从48mg/gMLVSS增长至139mg/gMLVSS,其中以TB层蛋白质增长为主,在颗粒化过程中,c-di-GMP含量由62mg/gMLVSS增至600mg/gMLVSS,始终影响微生物运动及生物膜形成,促使具备胞外聚合物分泌功能的菌群加快分泌胞外聚合物,促进好氧颗粒污泥的形成.各个阶段污泥中微生物种群存在较大差异,在反应器运行初始阶段与c-di-GMP合成相关的菌群占据优势,同时在后期表现出较好的脱氮除磷能力,在低温条件下好氧颗粒污泥微生物菌群发生演替并最终形成稳定的菌群结构.

c-di-GMP；低温；好氧颗粒污泥；胞外聚合物；群落演替

好氧颗粒污泥(AGS)具有特殊的生物膜结构,由于好氧颗粒污泥具有沉降性能好、生物量高、污染物去除能力强的优点,在生活污水和富含有毒有害物质的废水处理中均可发挥重要作用[1].我国南方地区污水处理厂冬季水温仅有8~12℃,长时间的低温条件会导致污泥中微生物活性及代谢能力下降,从而导致污水处理效果下降,提高污水处理的难度[2].c-di-GMP是新发现的一类信号分子,由两分子三磷酸腺苷(ATP)或腺苷二磷酸(ADP)经环化酶作用后形成,可被磷酸二酯酶分解为一个线性分子pApA或者两分子的磷酸腺苷(AMP)[3],可参与调节多种生理功能,包括细胞分化、细胞运动及生物膜状态的转变、产生致病因子等[4-6].c-di-GMP可调控细菌的运动方式,如多细胞群集、单细胞泳动、颤搐运动等[7].因此在好氧颗粒污泥的形成过程中,c-di-GMP可作用于细胞间的信息传递,促使微生物根据外部环境的变化进行自我调节.C-di-GMP含量增加会促使具备胞外聚合物(EPS)分泌功能的菌群加快分泌EPS[8],使微生物迅速凝聚面对外界的选择压力,通过微生物协同作用[9],进而促进好氧颗粒污泥的形成[10]. Angela等[11]研究发现,c-di- GMP可对污泥EPS的分泌产生重要作用,在颗粒污泥形成过程中投加Ca2+,可以改变颗粒污泥的菌群结构,促进sp和sp.等功能性菌群的生长,因而产生大量c-di-GMP,从而使颗粒污泥分泌较多EPS,形成具有稳定结构的好氧颗粒污泥.

本研究通过观察低温条件下絮状污泥颗粒化过程中胞外聚合物及其组分的变化规律,研究c-di-GMP对胞外聚合物产生的影响,揭示低温污泥颗粒化过程中微生物菌群的群落演替特点,阐明c-di-GMP在低温好氧颗粒污泥形成过程中的变化规律与功能作用.

1 材料与方法

1.1 试验装置与运行

采用内循环序批气提式反应器(SBAR)在低温条件下培养好氧颗粒污泥,SBAR反应器有效容积为6.0L,曝气量约为100L/h.实验周期为4h,进水60min、曝气160~170min、沉淀15~5min,排水5min(由于接种污泥沉降性能较差,初始沉降时间设为15min,随着反应器稳定运行逐渐降至5min),运行温度10°C,pH值约为7.0,排水比为50%[12].

1.2 接种污泥和试验污水

接种污泥取自某城市污水处理厂,初始接种污泥浓度约为2000mg/L.试验污水为人工配水,主要成分如下(mg/L):CH3COONa 625,NH4Cl 400, KH2PO430,K2HPO460, MgO440, CaCl280, EDTA 40, NaHCO3100.并投加微量元素液1mL/L[13],微量元素液成分如下(g/L): FeCl3·6H2O 1.5, H3BO30.15, CuSO4·5H2O 0.03, KI 0.03, MnCl2·4H2O 0.12, Na2MoO4·2H2O 0.06, ZnSO4·7H2O 0.12, CoCl2·6H2O 0.15.

1.3 EPS的提取与测定

取备用样品10mL,在20kHz,40W的条件下超声30s,然后在4℃,2000r/min条件下离心15min,收集上清液即为溶解型胞外聚合物(SMP-EPS);沉淀物用缓冲液稀释到原体积(10mL),加入0.06mL37%的甲酰胺,在4℃的恒温摇床培养箱轻微摇晃1h之后,将悬浮液在4℃,5000r/min条件下离心15min,收集上清液即为附着型胞外聚合物(LB-EPS);沉淀物用缓冲液稀释到原体积(10mL),加入4mL 1mol/L NaOH,在4℃的恒温摇床培养箱轻微摇晃3h之后,放入微量离心管中,在4℃,10000r/min下高速离心15min,收集上清液即为紧密结合型胞外聚合物(TB-EPS); EPS的蛋白质(PN)含量使用考马斯亮蓝法测定[12],多糖(PS)使用硫酸－蒽酮法测定[14].

1.4 c-di-GMP的提取与测定

在-80℃下冻干污泥,取0.2g冻干污泥溶于15mL超纯水中,加入15mg溶菌酶使污泥微生物细胞溶解,振荡15min后于37℃下培养1h;后将样品置于低温离心机中,在9000r/min下离心15min,转移上清液至50mL离心管中,加入2倍体积的无水乙醇,再次振荡10s后于4℃下培养1h;再次将样品置于低温离心机中,在9000r/min下离心15min,取沉淀物于37℃下培养3h,加入3mL超纯水后再次振荡10s;将混合液移至5mL离心管中,在12000r/min下离心10min,最后取1mL上清液,采用HPLC(Aglient,1260)进行测定[15].

1.5 污泥相关疏水性及zeta电位测定

相关疏水性(RH)指的是一个分子与水互相排斥的物理性质,疏水性分子偏向于非极性,因此易溶于中性和非极性溶液.利用微生物粘附碳烃化合物法测定微生物细胞表面相关疏水性[16].

采用zeta电位仪(Nano-Z, Malvern)测定污泥zeta电位[17].

1.6 微生物菌群分析

取一定量的污泥进行基因提取,对污泥样品中微生物的16S rDNA进行聚合酶链式反应(PCR)扩增后进行变性梯度凝胶电泳分析(DGGE),在2个50mL离心管中分别加入16mL30%和60%变性剂(100%变性剂为7mol/L尿素和40%离子甲酰胺的混合物),之后再依次加入90µL 10%硫酸铵和20µL四甲基乙二胺,混匀后,分别吸入2个注射器中,凝固后冲洗点样孔,取5µLPCR产物和5µL点样缓冲液混合均匀后点样,点样后的胶板置于60℃ 1x TAE缓冲液中,在150V下电泳6h.电泳结束后,剥胶染色,银染按Bassam[18]的方法进行.获得的DGGE图谱采用UMAX透射扫描仪扫描.

2 结果与讨论

2.1 进出水水质及EPS变化规律

在低温条件下运行SBAR,如图1所示,接种污泥进入低温环境后整体去除效能均较差,初期NH4+-N去除率仅约为55%,随着反应器的稳定运行,对NH4+-N的去除能力显著升高,出水NH4+-N浓度3mg/L左右,去除效率达到95%左右.且反硝化水平也在反应器稳定运行阶段达到了较好的提升,出水NO3--N浓度8mg/L左右.

Fig 1 Variations of N concentrations in influent and effluent

胞外聚合物具有较好的粘附性,因此在絮状污泥颗粒化过程中有助于微生物的吸附与聚集[19].由图2可知,在颗粒化过程中, EPS含量从48mg/ gMLVSS增长至139mg/gMLVSS,其中以蛋白质增长为主,蛋白质增量占EPS总增量的75%以上,蛋白质含量从31mg/gMLVSS增加到107mg/gMLVSS,表明蛋白质类物质为EPS内的主要成分,其在絮状污泥颗粒化过程中发挥重要作用,可维持在低温条件下好氧颗粒污泥的稳定性[20].在常温条件下运行好氧颗粒污泥反应器[21],接种污泥颗粒化过程中, EPS迅速增长,同样以蛋白质增加为主,由接种污泥的65mg/gMLVSS增加到好氧颗粒污泥的106mg/ gMLVSS,相较低温条件下所增长的PN类物质含量较低.随着反应器的运行,多糖含量从16.5mg/ gMLVSS增加到33mg/gMLVSS,由于多糖物质具有较好的粘附性,因此有助于形成粒径较大的好氧颗粒污泥.PN/PS在反应器运行的前25d内略有增加,反应器运行至30d后,PN/PS增加至3左右,在30~ 60d内,PN/PS基本维持不变,说明在30d左右好氧颗粒污泥基本成形,具有较好的稳定性.

图2 EPS及其组分的变化情况

由图3可知,TB-EPS中PN类的增加最为显著,从接种污泥的18mg/gMLVSS增加到了80mg/ gMLVSS,SMP-EPS和LB-EPS中PN类物质仅略有增高,增量均不高于5mg/gMLVSS. TB-EPS含量的升高有利于污泥颗粒化[22],因此在反应器运行35d左右后,TB-EPS中PN类物质含量仅略微升高,好氧颗粒污泥基本成型. LB-EPS的物质变化可影响污泥的沉降及脱水性能[23], LB-EPS中PN类物质的升高易形成松散的污泥结构,导致污泥沉降性能较差,本研究中LB-EPS中PN含量基本保持在10mg/ gMLVSS,因此在整体的絮状污泥颗粒化过程中好氧颗粒污泥表现出良好的沉降性能.由图4可知,絮状污泥颗粒化过程中多糖含量的变化甚微,其变化主要体现在SMP-EPS中PS含量的增长,SMP- EPS中PS含量从反应器运行初期的5mg/gMLVSS增加到13.5mg/gMLVSS,主要由于SMP-EPS中PS类物质在污泥颗粒结构中处于污泥外部或较易脱落的部位,因此在曝气环境下由于剪切力的作用,易转化为游离态EPS,从而导致SMP-EPS中的PS含量的上升.

图3 颗粒化过程中蛋白含量的变化

图4 颗粒化过程中多糖含量的变化

2.2 c-di-GMP变化规律及其与EPS的关联性分析

c-di-GMP作为近年来重点研究的第二信使,在多种微生物协调作用中存在,对生物膜的形成以及微生物的运动均有一定影响[24].如图5所示,接种污泥中c-di-GMP含量较低,仅为62mg/gMLVSS.随着反应器的稳定运行,c-di-GMP含量呈现先增加后降低的趋势.在反应器中出现明显凝聚体但未形成明显颗粒时,c-di-GMP含量最高,最高值约为600mg/ gMLVSS.随着好氧颗粒污泥的逐渐成熟,c-di-GMP的含量减少,最终稳定在270mg/gMLVSS左右,仍明显高于接种污泥的初始水平.

如图6所示,低温条件下好氧颗粒污泥中EPS, PN及PS3者与c-di-GMP含量相关性系数分别为0.95、0.94和0.95.c-di-GMP含量的变化对EPS, PN及PS 3者均具有一定程度的影响.c-di-GMP作为微生物分泌的信号分子,识别第一信使传递的信息,作用于下游靶细胞时,直接对分泌EPS的微生物传递信息,开启微生物对环境变化的响应机制[25],蛋白质和多糖是EPS的主要构成物,因此3者含量的变化规律与c-di-GMP的相关性变化趋势相似.

图5 颗粒化过程中c-di-GMP变化

图6 c-di-GMP与胞外聚合物相关性分析

由于在好氧颗粒污泥形成过程中TB-EPS变化最为明显,因此分析在低温条件下好氧颗粒污泥c- di-GMP含量与TB-EPS的关联性变化,结果表明TB-EPS中PN,TB-EPS中PS及TB-EPS 3者与c- di-GMP含量相关性系数分别为0.81、0.96和0.96 (图7).说明c-di-GMP含量的变化与TB-EPS中PN及TB-EPS相关性较强,c-di-GMP含量的上升可促进TB-EPS中TB-EPS中PN的分泌,表明TB-EPS中PN类组分是低温好氧颗粒污泥形成的重要因素.

图7 c-di-GMP与TB-EPS相关性分析

2.3 相关疏水性与zeta电位变化规律

图8 颗粒化过程中相关疏水性及zeta电位变化

如图8所示,污泥的相关疏水性在反应器运行的初始阶段快速上升,在40d后趋于稳定,相关疏水性基本维持在60%左右,表明在SBAR运行期间,絮状污泥通过增加表面疏水性以降低污泥表面自由能,使反应器中颗粒物间结合几率增加,进而促使微生物聚集体形成[26],疏水性颗粒间吸附能力增强,污泥微生物间更易结合,使好氧颗粒污泥粒径逐渐变大且更密实.同时在好氧颗粒污泥形成的过程中c-di-GMP含量不断增加,促进胞外聚合物中蛋白质类物质分泌,疏水性基团随之增多[27],污泥整体相关疏水性提高,同步促进了低温好氧颗粒污泥的形成.因此分析了相关疏水性与EPS中PN及TB-EPS中PN的关联性变化,结果表明,EPS中PN,TB-EPS中PN与相关疏水性相关性系数分别为0.947和0.941(图9).说明相关疏水性的变化与EPS中PN及TB-EPS中PN相关性较强.此外,在好氧颗粒污泥形成的过程中,污泥表面电荷增多,zeta电位逐渐升高,最后基本维持在-9mV左右,表明在颗粒污泥形成过程中污泥之间静电斥力减小,内部微生物所形成的小颗粒较不稳定,而使颗粒污泥间相对较易结合,有助于低温好氧颗粒污泥的形成[28].

图9 颗粒化过程中相关疏水性与EPS中PN及TB-EPS中PN的相关性分析

2.4 微生物种群解析

采用接种污泥与反应器运行第40,80,120d的污泥样品进行比较,如图10a所示,接种污泥(0d)由于是在常温条件下培养,因此其具有较丰富的生物多样性,微生物种类较为丰富.随着反应器在低温条件下的运行,由于部分微生物无法长时间适应低温环境而被逐渐淘汰,因此反应器运行第40d的污泥样品中微生物多样性较少.在反应进行至80d时,一部分由于低温条件而抑制自身生长及代谢的微生物缓慢适应了低温环境而得到恢复并逐渐稳定,因此第80及120d污泥样品中的微生物种类较第40d污泥样品中更为丰富.由图10b可知,各个阶段污泥中微生物种群存在较大差异,表明在低温条件下好氧颗粒污泥内部经历了微生物种群的演替并最终菌群结构趋于稳定.

a: DGGE图谱; b: 聚类分析

经过对接种絮状污泥在低温条件下的颗粒化培养,在接种的絮状污泥中较常见的条带4和7所代表的和因在低温SBAR中底物匮乏而逐渐被淘汰[29-30].在低温好氧颗粒污泥培养成功后,条带3,8及13成为此时期的优势菌群,条带8序列与菌株相似性高达99%,因其具有极强的耐冷能力而存在于SBAR中,属于污泥中的优势菌群[31].条带13所代表的对低温具有一定耐受性,但在较长时间的低温环境下,其生长代谢缓慢,因此在低温SBAR参数优化和稳定运行过程中被逐步淘汰[32];条带3所代表的属于反硝化细菌,处于好氧颗粒污泥的核心部位,与菌属类似,可利用NO3--N等电子受体进行无氧呼吸,此菌株会过量表达一类N-乙酰葡萄糖胺结合蛋白,此蛋白的表达由信号分子c-di-GMP以核糖开关的方式进行调控[33-35],因此在好氧颗粒污泥形成初期,第40d左右该条带在污泥菌群中占优势.条带9代表的菌属具有富集PHA及生物聚磷的能力,且其与铜绿假单胞菌高度同源,铜绿假单胞菌中基因为c-di-GMP合成的关键基因,基因为c-di-GMP的降解基因,可调节胞内c-di-GMP的浓度进而影响微生物运动、生物膜形成[36],因此其在污泥样品中成为优势菌群,促进好氧颗粒污泥的形成与稳定. SBAR运行至第120d时,条带11和14所代表的和成为优势菌群,二者分别具有在低温条件下氧化乙酸盐和NH4+-N的能力,促进了COD和NH4+-N的去除.条带2和12所对应的和在第120d污泥样品中为优势菌群,其具有在缺氧环境下利用NO3--N为电子受体进行反硝化的功能[37],表明好氧颗粒污泥在低温条件下仍可对污染物具有良好的去除效能.

3 结论

3.1 在低温条件下,SBAR培养约30d左右好氧颗粒污泥可初步成型,EPS含量从48mg/gMLVSS增长至139mg/gMLVSS,其中以蛋白质增长为主,TB-EPS中PN含量增加至80mg/gMLVSS,在颗粒化过程中发挥重要作用,维持了在低温条件下好氧颗粒污泥的稳定性.

3.2 在低温好氧颗粒污泥的形成过程中,絮状污泥可通过增加表面疏水性从而降低污泥表面自由能,使反应器中颗粒物间结合几率增加,进而促使微生物聚集体形成,形成稳定的好氧颗粒污泥.

3.3 污泥中c-di-GMP含量由62mg/gMLVSS增至600mg/gMLVSS.在反应器中出现明显凝聚体但未形成明显颗粒时,c-di-GMP含量最高,c-di-GMP与TB-EPS相关性较强,在反应器运行初始阶段促使具备EPS分泌功能的菌群加快分泌EPS,促进好氧颗粒污泥的形成.

3.4 各个阶段污泥中微生物种群存在较大差异,在反应器运行初始阶段与c-di-GMP相关的菌群占据优势并在后期表现出较好的脱氮能力,且好氧颗粒污泥微生物菌群发生演替并最终形成稳定的微生物菌群结构.菌属可调节胞内c-di-GMP的浓度进而影响微生物运动、生物膜形成,c-di-GMP可调控菌属对蛋白的表达.

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Effect of c-di-GMP in the formation of aerobic granular sludge at low temperature.

ZHI Li-ling1,2, WANG Yu-ying1,2, MA Xin-xin1,2, YI Xue-song3, WANG Shuo1,2, LI Ji1,2*

(1.School of Environmental and Civil Engineering, Jiangnan University, Wuxi 214122, China；2.Water Treatment Technology and Technology in Jiangsu Province Materials Collaborative Innovation Center, Jiangnan University, Suzhou 215009, China；3.College of Environment and Ecology, Hainan University, Haikou 570228, China)., 2019,39(4)：1560~1567

Along with the granulation process of floc sludge, signal molecules can lead to the variations of extracellular polymeric substances (EPS). In order to investigate the variations and effects of cyclic diguanylate (c-di-GMP) in the formation of aerobic granular sludge at low temperatures, the correlation analysis was carried out based on EPS, relative hydrophobicity (RH), zeta potential and community succession. The experimental results showed that EPS content increased from 48 to 139mg/g MLVSS during granulation, among which the significant increase was attributed to tightly bound-EPS (TB-EPS). The c-di-GMP content increased from 62 to 600mg/g MLVSS, which resulted in microbial succession and biofilm formation, and further improved the secretion of EPS and the formation of aerobic granular sludge. In addition, notable discrepancies were discovered in the microbial population, and the communities associated with the biosynthesis of c-di-GMP prevailed during the formation of aerobic granular sludge. The community succession was obvious and stable microbial community was eventually formed at low temperature, which was conducive to good performance of nitrogen and phosphorus removal.

c-di-GMP；low temperature；aerobic granular sludge；EPS；community succession

X703.5

A

1000-6923(2019)04-1560-08

2018-09-11

国家自然科学基金资助项目(51408264);国家水体污染控制与治理科技重大专项(2017ZX07202001-004,2017ZX07202001-005)

*责任作者, 教授, liji@jiangnan.edu.cn

支丽玲(1995-),女,江苏苏州人,江南大学硕士研究生,主要研究方向为信号分子在好氧颗粒污泥形成过程中的机理解析.