依达拉奉对缺氧缺血性脑病新生大鼠脑水肿及CD163/HO-1信号通路的影响

韩遵华，段 淼，李清香

(贵州省遵义市第一人民医院新生儿科，贵州 遵义 563002)

新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)是新生儿在围生期因缺氧而引起的缺氧缺血性脑损伤(hypoxic ischemic brain damage，HIBD)，临床上常表现为意识障碍、脑水肿、高颅压、肌张力改变等神经系统症状[1]。脑水肿、出血是新生儿HIE早期重要的病理变化，也是导致病情进展和恶化的重要因素[2]。清道夫受体蛋白CD163/HO-1(heme oxygenase-1)信号通路在血红蛋白(haemoglobin，Hb)分解代谢中起着关键作用，还具有抗脂质过氧化和抗炎作用[3-4]。研究发现，CD163、HO-1在脑出血所致脑损伤组织中的表达明显升高，可促进脑水肿吸收，减轻脑组织损害[5]。依达拉奉是一种自由基清除剂，主要用于治疗脑梗塞急性期患者，它可通过清除自由基，避免脂质过氧化，抑制脑、血管内皮和神经细胞的氧化损伤，进而缓解脑缺血引起的脑水肿、脑梗塞[6]。但依达拉奉是否可用于治疗新生儿HIE尚无具体报道。因此，本研究通过建立新生大鼠HIBD模型，探究依达拉奉对HIE新生大鼠脑水肿及CD163/HO-1信号通路的影响，以期为依达拉奉临床应用提供理论指导。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级7日龄SD新生大鼠11窝共120只，体重12～16 g，雌雄不限，由重庆第三军医大学野战外科研究所动物室提供[SCXK (渝) 2012 - 0001]，饲养于SPF级实验室[SYXK (渝) 2017-0012]。饲养的环境温度: (22±2)℃，相对湿度 50% ～ 60%，光照 12 h /12 h 明暗交替，每笼 5 只。实验过程中按实验动物使用的 3R原则给予人道主义关怀。

1.2 主要试剂与仪器

550D数码相机(日本佳能公司),Image J软件(National Institutes of Health，美国)；GIS-2020数码图像分析系统(宁波新芝生物科技股份有限公司)。依达拉奉注射液(规格号：国药准字H200502820，购自南京先声东元制药有限公司)，Rat Brain Matrix(Zivic Instruments，USA)；2,3,3-三苯基氯化四氮唑(TTC，美国Sigma-Aldrich公司)；NCBI Primer Blast设计定量引物序列(由上海生工生物工程有限公司合成)；RNA提取试剂盒(美国Invitrogen公司)；反转录试剂(宝生物大连公司)；实时荧光定量PCR仪(Beckman Couhe公司)；组织蛋白提取试剂(南京凯基生物公司)；BCA法进行蛋白定量(南京建成生物工程研究所)；硝酸纤维素膜(上海基因公司)；β-actin兔抗大鼠IgG溶液(美国Sigma公司)；二抗稀释液(1∶1000碱磷酶标记山羊抗兔IgG溶液，美国Sigma公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物模型建立

根据Rice等[7]方法建立HIBD模型，将7日龄SD新生大鼠麻醉后，仰卧固定于手术台，颈部用75%酒精消毒，于颈部正中切口，游离左侧颈总动脉并在远、近心端进行双结扎，缝合伤口并消毒后放回母鼠旁恢复2 h。然后将新生大鼠放入的缺氧玻璃舱内，缺氧舱浸泡在37℃恒温水浴中，同时向舱内不断通入8% O2和92% N2混合气体，持续缺氧2 h。最后将新生大鼠放回母鼠处继续喂养。假手术组新生大鼠只游离左侧颈总动脉穿线但不结扎，缝合伤口后不进行缺氧处理。

1.3.2 分组与给药处理

将术后的90只HIBD新生大鼠随机分为依达拉奉治疗组(即依达拉奉组)和模型组各45只，另取30只新生大鼠行假手术作为假手术组。各组又分为6个亚组即6 h、12 h、24 h、2 d、3 d、5 d组。将依达拉奉注射液用生理盐水(体积比1∶4)稀释为0.3 mg/mL，依达拉奉组在术后立即给予腹腔注射依达拉奉2 mg/kg，间隔24 h给药1次，连续5 d。模型组和假手术组给予腹腔注射等量生理盐水。

1.3.3 脑组织标本的处理

各组新生大鼠在术后相应时间点断头取出脑组织，用10%多聚甲醛在室温下固定24 h，沿左侧脑组织视交叉处冠切，做成石蜡包块，连续冠状切片，进行相关检测。另取每组新生大鼠左侧脑组织于液氮中冻存，待标本集齐后进行后续qRT-PCR和Western blot实验。

1.3.4 2,3,5-三苯基四氮唑一水合物(TTC)染色

造模后24 h，各组随机取4只新生大鼠断头取出脑组织，浸泡在4℃ 0.15 mol/L PBS中5 min，采用Rat Brain Matrix沿大脑冠状面进行切片，切片厚2 mm；将切片浸泡在含2%TTC的0.15 mol/L PBS中，室温孵育30 min；用4℃ PBC冲洗两遍后，于4℃ 10%福尔马林缓冲液中避光固定。照相后，用Image J 1.8.0软件测量梗死面积。红色为正常脑组织，白色为梗死区脑组织。统计参数用梗死面积占同侧脑半球总面积百分比来表示。

1.3.5 脑组织含水量测定

用干湿比重法[8]进行测定，每组新生大鼠在术后时间点处死，断头开颅后迅速将脑组织取出，用电子天平称脑组织湿重(精确到0.1 mg)。然后置于100℃恒温烘箱中24 h左右，待质量恒定后称脑组织干重。按Elliot公式，脑含水量=(湿重-干重)/湿重×100%。脑水肿程度用脑含水量来表示。

1.3.6 qRT-PCR实验

以β-actin作为内参基因，用NCBI Primer Blast设计定量引物序列，引物序列如下：

CD163：上游引物(5′ to 3′)：AGCATGGAAG CGGTCTCTGTGATT，下游引物(5′ to 3′)：AGCTG ACTCATTCCCACGACAAGA。HO-1：上游引物(5′ to 3′)：A CCGCCTTCCTGCTCAACAT，下游引物(5′ to 3′)：GGGCGTCTCTGCAGAGGTAG。β-actin：上游引物(5′ to 3′)：TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT，下游引物(5′ to 3′)：CACGATGGAGGGGCCGGA CTCATC。

取出每组液氮冻存的脑组织，利用Trizol法提取RNA，经琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，并用紫外分光光度计检测其纯度及浓度。取1 μg总RNA，用反转录试剂合成cDNA。合成cDNA第一链后，取5 μL cDNA(稀释20倍)为模板，加入10 μL 2×SYBR Green qPCR Super Mix、0.5 μL GAPDH(或CD163、HO-1)上下游引物、4.0 μL ddH2O至20 μL，在实时荧光定量PCR仪上扩增。反应条件：预变性95℃ 30 s；扩增40个循环95℃ 5 s，60℃ 35 s。实验进行3次生物学重复。采用2-ΔΔCT法分析qRT-PCR结果，ΔCT=CT目的基因- CT内参基因，ΔΔCT=ΔCT目的基因- ΔCT内参基因。

1.3.7 Western blot分析

取每组大鼠脑组织充分研磨，用组织蛋白提取试剂常规提取蛋白。每组取4 μL蛋白样品，用BCA法进行蛋白定量，调节好蛋白浓度；将蛋白样品与等体积2× SDS缓冲液混合后加热变性；接着通过SDS-PAGE电泳分离上清液；把分离的蛋白质转印到硝酸纤维素膜上；将膜洗涤后在5%牛血清蛋白溶液中室温封闭1 h；洗涤后将膜置于一抗稀释液(1∶100的CD163、HO-1、β-actin兔抗大鼠IgG溶液中，4℃孵育过夜；次晨将膜快速清洗后，转移到二抗稀释液中，在室温下孵育2 h；清洗后用新配制的显色液进行显色，待出现清晰的条带后终止；最后使用GIS-2020数码图像分析系统扫描并分析蛋白杂交条带。

1.4 数据统计分析

2 结果

2.1 SD新生大鼠模型行为观察

术前所有SD新生大鼠生物学行为正常。术后模型组和依达拉奉组新生大鼠在低氧舱中10～15 min后开始出现烦躁不安；缺氧30 min后呼吸频率加快，不能站稳，翻滚，逐渐出现全身震颤，不能翻身，夹尾左旋；1 h后出现嗜睡，不爱活动，精神萎靡，少数出现抽搐情况，均未死亡，呈现先兴奋后抑制行为。假手术组新生大鼠的行为无明显异常。造模后置于正常环境，发现模型组新生大鼠症状逐渐加重，2～3 d时最为严重，6～7 d时症状减轻；依达拉奉治疗后症状也加重，2 d时最为严重，但较模型组明显减轻，3 d内症状改善。

2.2 SD新生大鼠脑组织形态观察

TTC染色结果发现，造模后24 h模型组新生大鼠大脑左半球皮层、海马、纹状体等区域出现水肿、颜色苍白，左半球体积比右半球稍大，而依达拉奉治疗后脑组织损伤程度显著降低。结果见图1A。经定量分析发现，与假手术组相比，模型组和依达拉奉组新生大鼠大脑左半球梗死面积均显著增加(P<0.05)。与模型组相比，依达拉奉治疗后脑梗死面积显著减小(P<0.05)。结果见图1B。

2.3 SD新生大鼠脑组织含水量变化

术后6 h，与假手术组相比，模型组、依达拉奉组新生大鼠脑组织含水量均明显升高(P<0.05)，2 d时脑含水量最高。依达拉奉治疗后新生大鼠脑组织含水量明显低于模型组(P<0.05)。结果见表1。

2.4 SD新生大鼠脑组织CD163、HO-1 mRNA表达水平

qRT-PCR结果显示，与假手术组相比，模型组、依达拉奉组新生大鼠脑组织CD163、HO-1 mRNA表达水平均显著升高(P<0.05)，在24 h时，CD163 mRNA表达水平达到最高随后趋于平稳，而HO-1 mRNA表达水平达到最高时逐渐下降。但依达拉奉治疗后新生大鼠CD163、HO-1 mRNA表达水平显著高于模型组(P<0.05)。结果见图2。

注：A：各组典型脑梗死图片。B：各组脑组织梗死面积。与假手术组相比，*P<0.05；与模型相比，#P<0.05。图1 造模后24 h各组SD新生大鼠脑梗死情况(n=4)Note. A，Typical pictures of brain infarct in each group.B, Brain infart area of each group. Compared with the sham operation group,*P<0.05. Compared with model group,#P<0.05.Figure 1 Infarct size of each group of neonatal rats at 24 h after model establishment

表1 各组SD新生大鼠在不同时间点脑组织含水量变化

注：与假手术组相比，*P<0.05；与模型组相比，#P<0.05。

Note. Compared with the sham operation group,*P<0.05. Compared with the model group,#P<0.05.

注：A：CD163 mRNA表达变化。B：HO-1 mRNA表达变化。与假手术组相比，*P<0.05；与模型相比，#P<0.05。以β-actin作为内参基因。图2 各组新生大鼠不同时间点脑组织CD163、HO-1 mRNA表达变化(n=6)Note. A，The expressing of CD163 mRNA.B，The expressing of HO-1 mRNA.Compared with the sham operation group,*P<0.05. Compared with the model group, #P<0.05.Figure 2 Changes of the expression of CD163 and HO-1 mRNA in each group of the neonatal rats at different time points

2.5 SD新生大鼠脑组织CD163、HO-1蛋白表达水平

Western blot结果显示，与假手术组相比，模型组、依达拉奉组新生大鼠脑组织CD163、HO-1蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)，依达拉奉治疗后，新生大鼠CD163、HO-1蛋白表达水平显著高于模型组(P<0.05)，与qRT-PCR结果一致。结果见图3。

注：与假手术组相比，*P<0.05。与模型组相比，#P<0.05。图3 各组新生大鼠不同时间点脑组织CD163、HO-1蛋白表达变化(n=6)Note. Compared with the sham operation group,*P<0.05. Compared with the model group, #P<0.05.Figure 3 Changes of the expression of CD163 and HO-1 proteins in each group of the neonatal rats at different time points

3 讨论

新生儿HIE是围生期的常见病，其发病率仅次于新生儿黄疸和肺炎，易造成新生儿死亡，且幸存儿常伴有智力低下、脑瘫、癫痫等神经系统后遗症[8-11]。研究发现脑组织缺氧缺血后，花生四烯酸被环加氧酶、脂氧化酶氧化是引起脑损伤的初步反应，进一步导致氧自由基、一氧化氮、炎症因子等产生增加，胞膜脂质被过度氧化，膜上离子泵遭到破坏，钠离子、钙离子、水分子等进入胞内，导致神经细胞水肿、凋亡以及坏死[12-13]。新生儿HIE目前尚无既安全又有效的治疗手段，因此根据其发病机理寻找新的治疗药物尤为重要。

依达拉奉是临床常用的脑保护剂，其在治疗急性脑梗死、脑出血及其相关疾病具有很好的疗效，它可通过清除自由基防止脂质过氧化；保护脑组织、血管内皮免受氧化损伤，从而减轻脑缺血引起的脑水肿、脑梗塞[14-15]，故在理论上它能够治疗新生儿HIE。本研究参照Rice等[7]HIBD模型经典创建方法，选用与新生儿神经发育类似的7日龄新生大鼠，术后缺氧过程中新生大鼠出现呼吸加快、发绀、站立不稳，随后新生大鼠行为能力发生障碍，夹尾旋转；显微镜观察发现结扎侧大脑形态异常，出现脑含水量增加，脑组织肿胀，脑梗死等。与前人造模结果[7]一致。经依达拉奉治疗HIBD新生大鼠后，上述行为学症状明显改善；模型组新生大鼠大脑左侧脑含水量显著增加，脑肿胀程度严重，梗死区域较大，而依达拉奉治疗后左侧脑含水量显著减少，脑肿胀程度减轻，梗死面积显著减小，说明依达拉奉治疗能明显减轻HIBD新生大鼠脑水肿、脑梗死程度。

研究发现，缺氧缺血脑损伤组织中CD163、HO-1的表达明显增加[16-17]。CD163属于富半胱氨酸清道夫受体家族(SRCR)成员，通常分布于单核-巨噬细胞膜表面，在单核细胞发育成巨噬细胞过程中，其表达持续上升。小胶质细胞在生理条件下不表达CD163，在受到Hb刺激后才开始表达CD163。血浆中Hb的主要结合蛋白是触珠蛋白(Hp)，Hb-Hp结合物能被单核或巨噬细胞膜上CD163受体摄入胞内，其在内质体中分解为强氧化物——血红素，其生成后可由内质体转移至溶酶体，血红素氧化酶(HO)可催化其代谢为亚铁离子、一氧化碳以及胆绿素，血红素具有很强的神经毒性，易造成继发性脑损伤。HO包括两种亚型：HO-1和HO-2，脑损伤后HO-1在神经系统起关键作用，因此脑损伤后CD163/HO-1途径为Hb分解代谢的重要途径[18-19]。在正常生理条件下，每天约10%红细胞发生退化，退化红细胞内的Hb可通过CD163/HO-1途径分解清除。然而，在病理条件下，CD163/HO-1途径分解Hb的作用加强，CD163、HO-1在脑损伤引起的脑水肿组织中的表达明显增加[20]。此外，CD163还具有抗脂质过氧化、抗炎作用[21]。因此，本研究通过双结扎新生大鼠左颈总动脉并缺氧制作HIBD模型，比较依达拉奉治疗组和模型组中脑水肿组织周围CD163与其下游蛋白HO-1的转录和蛋白表达变化，对依达拉奉治疗与脑水肿组织CD163、HO-1转录和蛋白表达的相关性做了基本的研究和探讨。本研究结果显示模型组、依达拉奉组新生大鼠脑组织中CD163、HO-1的表达水平显著高于假手术组，而且依达拉奉治疗后新生大鼠脑组织中CD163、HO-1的转录和蛋白表达水平明显高于模型组，说明依达拉奉可能通过激活CD163/HO-1信号通路来减轻HIBD新生大鼠脑水肿、脑梗死程度。这充实了CD163/HO-1途径在缺氧缺血脑损伤方面实验研究，为依达拉奉临床治疗新生儿HIE提供了实验依据和理论指导。

模型组新生大鼠脑损伤组织中CD163、HO-1 mRNA和蛋白表达水平显著增加；依达拉奉治疗后新生大鼠脑组织中CD163、HO-1的转录和蛋白表达水平明显增高，且依达拉奉治疗能明显减轻HIBD新生大鼠脑水肿、脑梗死程度。新生儿HIE发生发展的相关因素很多、相关机制复杂，依达拉奉最终在临床上能否治疗新生儿HIE，还需继续深入的研究。