参麦对急性脑梗死小鼠脑组织的保护作用及相关机制的探讨

阮中繁，谢 明*，李 艳，王桥生

(1. 南华大学附属第一医院神经内科；2.南华大学附属南华医院麻醉科；3. 南华大学附属第一医院重症医学科，湖南 衡阳 421000)

急性脑梗死(acute cerebral infarct，ACI)是指脑部供血障碍引起的脑组织坏死，具有较高的致死率和致残率，严重威胁国民健康[1]。参麦注射液是由红参和麦冬两味中药制备而成的复方制剂，现代药理学发现，其具有改善微循环，增强免疫力，增加脑血流量，降低脑组织耗氧量及清除自由基的作用[2]。研究发现，参麦注射液对于急性脑梗死的治疗具有较好的临床疗效，但其机制还尚未明确[3]。B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)是一类抑制细胞凋亡的蛋白，钙蛋白酶1(calcium activated papain-like cysteine protease-1, calpain-1)是一种降解各种肌肉蛋白的酶[4-5]。研究发现，上调Bcl-2和calpain均可减轻脑缺血性损伤[6]。因此，本研究通过构建急性脑梗死小鼠模型并给以参麦注射液干预，测定Bcl-2和calpain-1的表达来探讨参麦注射液对其作用及相关机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

6周龄SPF级雄性CD-1小鼠30只，体重25～30 g，购于南华大学实验动物中心[SCXK(湘)2015-0002]，饲养于南华大学实验动物中心屏障环境中[SYXK(湘)2015-0001]。常规饲料喂养，自由饮用洁净水(均由南华大学实验动物中心提供)。饲养环境： 12 h光照/12 h黑暗，黑暗，湿度恒定，温度20℃～25℃。所有操作均符合实验动物伦理学要求(伦理审批号：TSME1 2016-001)。

1.2 主要试剂与仪器

A1级MCAO线栓(广州佳灵生物技术有限公司)，参麦注射液(神威药业集团有限公司，规格10 mL×5支，国药准字Z13302088)，0.9%氯化钠注射液(湖南科伦制药有限公司， 500 mL，国药准字H43020454)，4%多聚甲醛(北京索莱宝生物科技有限公司)，Abgent alpain-1单克隆抗体，Bcl-2单克隆抗体(北京拜尔迪生物技术有限公司)，TRIzolTMReagent(购自赛默飞世尔科技中国有限公司)；DAB 显色试剂盒(北京中杉生物工程有限公司)，TUNEL试剂盒(默克生命科学)。半自动轮转式切片机CUT5062(北京莱比信科技发展有限公司)，ND-2000超微量分光光度计(北京科誉兴业科技发展有限公司)，光学显微镜(北京博恒远科技有限公司)，超低温冰箱(中科美菱低温科技有限责任公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 模型构建及处理

本实验以30只成年雄性CD-1小鼠为研究对象，随机分为对照组、模型组和实验组，每组各10只。按照文献法[7]构建小鼠永久性大脑中动脉闭塞(permanent middle cerebral artery occlusion, pMCAO)模型，对照组接受假手术操作1 h后腹腔注射0.3 mL生理盐水，每天1次；模型组小鼠接受线栓法大脑中动脉闭塞手术 1 h后腹腔注射0.3 mL生理盐水，每天1次；实验组小鼠接受线栓法大脑中动脉闭塞手术后1 h腹腔注射0.3 mL参麦注射液，每天1次。三组小鼠均干预2周。

1.3.2 红细胞免疫功能指标的检查

采用眼球后静脉丛采血1 mL置于枸橼酸钠抗凝管中，离心取上层血浆备用，从下层取出50 μL红细胞加450 μL 0.9%氯化钠注射液混匀，检测红细胞浓度，加0.9%氯化钠注射液稀释至终浓度1.25×107/mL。将冻存致敏酵母菌混匀，将50 μL红细胞液与50 μL血浆及50 μL酵母菌混匀，37℃水浴10 min，加入25 μL 0.25%戊二醛，分别取1/2的量以毛细吸管涂片，吹干，加100 μL甲醇固定后，采用瑞氏染液与缓冲液(1∶3)染色30 s，自来水冲洗3遍后，湿片镜检并计数(与红细胞结合2个以上酵母菌)，得出红细胞复合物花环形成率(red blood cell- immune complex rosette，RBC-ICR)。同法测定红细胞表面C3b受体(RC3bR)。

1.3.3 TUNEL试剂盒检测各组神经元凋亡

制备脑组织石蜡切片，依据TUNEL试剂盒说明书操作，光学显微镜下观察各组小鼠脑组织凋亡神经元并拍照计数。

1.3.4 Western blot法检测calpain-1、Bcl-2蛋白水平的影响

剪取部分脑组织提取总蛋白，调整蛋白浓度后进行蛋白电泳，转膜后进行封闭，清水洗膜后，Abgent calpain-1单克隆抗体或Bcl-2单克隆抗体4℃孵育12 h。洗膜后，室温孵育荧光标记羊抗兔抗体2 h，免疫印迹显色后进行曝光，采用ImageJ软件对条带进行分析。

1.3.5 q-PCR法检测calpain-1、Bcl-2 mRNA的表达

剪取部分脑组织，液氮研磨后严格按照Trizol试剂盒说明书提取总RNA，并将总RNA逆转录为总cDNA，进行荧光定量反应。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 各组红细胞免疫功能比较

与对照组比较，实验组RBC-C3bR明显降低，RBC-ICR显著升高(P<0.05)。与模型组比较，实验组RBC-C3bR明显增高，RBC-ICR显著降低(P<0.05)，见表1。

2.2 各组脑组织的神经元凋亡率比较

对照组小鼠脑组织切片TUNEL阳性细胞较少，模型组和实验组小鼠脑组织切片的 TUNEL阳性细胞数显著高于对照组(P<0.05)； 实验组小鼠脑组织切片的TUNEL阳性细胞数明显低于模型组小鼠(P<0.05)，见图1。

2.3 各组脑组织calpain-1、Bcl-2蛋白水平比较

与对照组小鼠比较，模型组和实验组小鼠的calpain-1蛋白显著升高，Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P<0.05)；与模型组小鼠相比，实验组小鼠calpain-1蛋白表达水平显著降低，Bcl-2 蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，见图2。

2.4 各组脑组织calpain-1、Bcl-2 mRNA水平比较

与对照组小鼠比较，模型组和实验组小鼠的calpain-1 mRNA表达水平显著升高，Bcl-2 mRNA表达水平显著降低(P<0.05)；与模型组小鼠相比，实验组小鼠calpain-1 mRNA表达水平显著降低，Bcl-2 mRNA表达水平显著升高(P<0.05)，见图3。

表1 各组红细胞免疫功能比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

Note. Compared with the control group,*P<0.05. Compared with the model group,#P<0.05.

注：A：对照组；B：模型组；C：实验组。与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。下图同。图1 各组脑组织的神经元凋亡率比较Note. A, Control group. B, Model group. C, Experiment group. Compared with the control group, *P<0.05.Compared with the model group, #P<0.05. The same in the following figures.Figure 1 Comparison of neuronal apoptosis rates in the brain tissue of each group

注：(1)各组脑组织中Bcl-2、calpain-1蛋白的表达；(2)各组脑组织中Bcl-2蛋白表达统计分析；(3)各组脑组织中calpain-1蛋白表达统计分析。图2 各组脑组织Bcl-2、calpain-1蛋白水平比较Note. (1) Calpain-1 and Bcl-2 protein levels in brain tissue of each group. (2) Bcl-2 protein levels. (3) Calpain-1 protein levels.Figure 2 Comparison of calpain-1 and Bcl-2 protein levels in the brain tissue of each group

注：(1)各组脑组织中Bcl-2 mRNA水平的统计分析；(2)各组脑组织中calpain-1 mRNA水平的统计分析。图3 各组脑组织Bcl-2、calpain-1 mRNA水平比较Note. (1) Bcl-2 mRNA levels in brain tissue of each group. (2) Calpain-1 mRNA levels in brain tissue of each group.Figure 3 Comparison of Bcl-2 and calpain-1 mRNA levels in the brain tissue of each group

3 讨论

ACI是人类死亡和致残的主要原因[7]。目前临床上治疗此疾病的主要方式为溶栓治疗，由于时间窗较狭窄，因此仅有小部分患者能接受溶栓治疗。因此，选择接近临床实际情况的脑梗死动物模型进行药物研究具有重要的价值。中药制剂疗效确切、安全性高、价格低廉，已经广泛运用于临床治疗中[8]。参麦注射液主要成分为红参、麦冬，具有益血生津、补气滋阴的作用，有文献报道，参麦注射液可显著提高急性脑梗死的治疗效果，但机制研究较少[9-10]。因此，本研究通过构建急性脑梗死小鼠模型并进行参麦注射液干预治疗，探讨其作用机制。

pMCAO模型具有操作性强和重复性高的优点，是目前国际上应用较为广泛的脑梗死动物模型，模型构建成功后可模拟脑梗死的病理过程进行缺血后继发脑损伤的研究，并且数分钟内可诱导炎症反应及凋亡等一系列继发性脑损伤[11]。本实验通过线栓法大脑中动脉闭塞手术构建pMCAO模型小鼠，目的是研究参麦注射液对模型小鼠红细胞免疫功能及凋亡的影响。参麦注射液是由生脉散改变剂型而成，包含人参皂甙、麦冬黄酮等有效成分[12]。人参皂甙可有效改善脑损伤组织的代谢，麦冬黄酮可改善脑细胞的能量缺乏及缺氧状态。参麦注射液被广泛地运用到心脑血管病、脓毒血症、肿瘤、膝骨关节炎等疾病，并取得较好的疗效。在治疗脑血管疾病上，陈中明等[13]采用参麦注射液辅助治疗急性脑梗死患者，发现治疗后联合用药组明显改善凝血功能，降低VEGF、GFAP 和 TNF-α水平，提示其具有抗凝、抗炎、改善血液循环，从而发挥疗效。耿武军等[14]发现参麦注射液通过上调Bcl蛋白和Bcl/Bax比率改善脑缺血再灌注损伤大鼠的脑损伤。红细胞免疫是目前免疫学领域中重要的研究内容，研究发现，机体发生脑梗死时，RBC-ICR升高，RBC-C3bR降低，从而降低机体的免疫功能[15]。本研究采用参麦注射液对急性脑梗死模型小鼠进行干预治疗。结果发现，实验组RBC-C3bR明显高于模型组，RBC-ICR显著低于模型组。结果表明了参麦注射液能够改善模型小鼠的红细胞免疫功能，与以往研究一致[13]。

Bcl-2家族在在细胞凋亡过程中发挥重要作用。Bcl-2可通过细胞凋亡信号途径阻遏细胞凋亡，延长细胞寿命[15]。calpain家族在脑缺血后细胞凋亡过程中扮演重要角色，研究发现，缺血再灌注后1 h，脑部皮层和海马calpain活性明显增高，再灌注后24 h calpain活性可再次达到最高水平[16]。calpain-1是calpain主要的亚家族成员之一，可裂解多种酶，选择性降解细胞骨架蛋白及转录因子等。calpain-1可通过裂解半胱氨酸蛋白酶Caspases-3、7、8等，并可调节Bcl家族介导凋亡。本结果发现，模型组和实验组小鼠脑组织切片的 TUNEL阳性细胞数显著高于对照组，实验组小鼠脑组织切片的TUNEL阳性细胞数明显低于模型组小鼠，结果说明了参麦注射液能够抑制神经元的凋亡。推测其原因可能是参麦注射液具有降低氧自由基，减少脑组织损伤后脂质过氧化物生成作用，且可促进ATP 合成，提高Na+-K+-ATP 酶活性及膜转运电位，抑制Na+、K+内流，减轻脑水肿，发挥神经元的保护作用，抑制神经元的凋亡。进一步研究其机制，结果发现，实验组小鼠calpain-1蛋白和mRNA表达水平低于模型组，Bcl-2蛋白和mRNA表达水平高于模型组。结果说明，参麦注射液可通过上调Bcl-2蛋白的表达，下调calpain-1蛋白的表达，从而抑制神经元的凋亡。

综上所述，参麦注射液可改善急性脑梗死小鼠红细胞功能和抑制神经元凋亡，其可能的机制是下调calpain-1蛋白的表达，上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，发挥脑组织神经保护作用。