Toll样受体信号通路作为结直肠癌潜在治疗靶点的研究进展

刘恒辰 张新宇

全球每年约有125万人被诊断为结直肠癌(CRC)，并有超过60万人死于该疾病[1]。CRC的标准治疗方式包括手术切除、放射治疗和以氟吡嘧啶、奥沙利铂和伊利替康为主的化疗。尽管在癌症治疗方面取得了进步，但其5年生存率仍为60%[2]。因此，仍需其他的辅助途径来控制结直肠癌的发展。Toll样受体(TLRs)属于模式识别受体(PRRs)家族，其主要表达于固有免疫细胞表面并调节固有免疫应答及适应性免疫应答。TLRs信号通路的异常激活可导致慢性炎症性疾病的发展[3]。大量数据表明，TLRs信号通路参与多种疾病的发生发展，如哮喘、动脉粥样硬化、自身免疫性疾病、糖尿病、Crohn病和溃疡性结肠炎等[4]。有研究表明TLRs信号通路可在肿瘤的发生发展中体现抗肿瘤与促肿瘤的双重作用[5]。而TLRs激动剂则具有强大的抗肿瘤作用，并已逐渐将其应用于临床抗肿瘤疫苗中。

1 TLRs信号通路的研究进展

TLRs是I型跨膜糖蛋白，其特征在于富含亮氨酸重复序列(LRRS)的胞外域，和一个称为Toll/IL-1受体结构域(TIR)的细胞质尾[6]。TLRs信号通路被激活后在两个LRR结构域之间形成一个桥，TIR-TIR相互作用并发生受体二聚化，进而激活下游信号通路表达。细胞表面TLRs包括TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR10，细胞内TLRs包括TLR3、TLR7、TLR8、TLR9、TLR11、TLR12和TLR13[3]。TLRs识别高度保守的分子结构，称为病原体相关分子模式(PAMPS)，是机体抵抗感染性疾病的第一道屏障。PAMPs包括各种细菌细胞壁成分，如脂多糖(LPS)、肽聚糖(PGN)、脂肽、鞭毛蛋白、细菌DNA和病毒双链RNA(dsRNA)等。TRLs通过识别不同PAMPs引起特异性免疫应答，目前发现的配体蛋白有四种：MyD88、TIRAP、TRIF和TRAM[7]。除了PAMPS，TLRs的损伤相关分子模式(DAMPs)为细胞自身死亡和释放内源性分子，如高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、热休克蛋白(HSPs)、纤维连接蛋白、纤维蛋白原、肝素和单链RNA等[8]。

早期研究表明TRLs主要分布于免疫细胞中，近年来研究发现TLRs也在肿瘤组织中表达，对癌症的治疗具有潜在作用。虽然TLRs激活的抗癌机制尚不清楚，但近来研究已经显示了它们可以诱导肿瘤细胞凋亡[9]。胃肠道上皮细胞内TLRs的表达对调节上皮细胞增殖、屏障稳态和凋亡反应起着关键作用，为机体抵御病原体和肿瘤病变提供了第一道防线[10]。炎症性肠病减弱了TLRs信号通路在胃肠道中的表达，促进机体发展成为CRC[11]。TLRs信号通路异常激活可导致NF-κB信号通路的激活和IL-1β、TNFα、IL-6等炎性因子的过度表达。肿瘤可以通过DAMPs异常激活TLRs信号通路，并与TLRs结合[12]。TLRs信号通路还可以通过调节基质金属蛋白酶(MMPs)和整合素增加肿瘤细胞侵袭和转移，加速CRC的进展[13]。

此外TLRs激动剂具有强大的抗肿瘤作用，其主要表现在刺激抗原呈递细胞(APC)进而刺激肿瘤特异性T细胞毒性淋巴细胞(CTL)应答[14]。在肿瘤局部应用其特异性表达的TLRs激动剂可以提高免疫治疗的疗效[14]。随着TLRs激动剂逐渐应用于临床治疗CRC，一些生物技术公司也着手生产新的药物制剂。然而，将它们作为单一疗法或联合放化疗的应用尚处于早期临床开发阶段，仍需要进一步的研究。

2 TLRs信号通路与CRC

2.1 TLR2/4

TLR2和TLR4与他们的配体结合形成二聚体复合物，并在细胞中激活相应的配体蛋白[15]。据报道TLR2的表达可能参与了散发性结直肠癌的发生[16]。TLR4通路的激活可导致活性氧簇(ROS)、活性氮簇(RNS)生成增多，进而启动氧化应激机制[17]。也有研究表明，表达于人结肠癌中的TLR4可诱导免疫抑制因子和细胞凋亡抗性，过度表达的TLR4多提示其预后不良[18]。

有证据表明[19]，TLR2和TLR4的单个核苷酸多态性(SNPs)与结肠癌的生存率相关。因此，TLR2与TLR4的表达影响着结直肠癌的发生发展。TLR4在促进抗肿瘤T细胞释放中起到关键作用[20]。此外，益生菌的混合物可以通过增加大鼠TLR2信号转导发挥抗癌作用[21]，TLR2基因缺陷小鼠具有更高的肿瘤易感性[22]，充分说明了TLR2对结肠炎相关癌症的发展起保护作用。

2.1.1 OM-174 OM-174是对TLR2/4具有双重作用的类脂类似物。在第一阶段临床试验中，给予常规肿瘤治疗无效的患者每周两次的OM-174静点，其药物耐受性表现良好，最常见的并发症是寒战(70%)、发热(41%)、恶心(23%)、呕吐(23%)、疲劳(23%)、腹泻(17%)和头痛(17%)[23]。

2.1.2 减毒分枝杆菌(BCG) 死亡的脓链球菌、粘质沙雷氏菌(Coly毒素)和减毒分枝杆菌(BCG)的混合物现已应用于癌症的临床治疗。这种混合物是TLR2和TLR4共同的激动剂。在电离辐射之前将HCT116结肠癌细胞暴露于BCG中，可以增加肿瘤细胞的死亡和自噬诱导[24]。BCG在结直肠癌患者中的第一、二阶段临床试验已完成。在第三阶段试验中，BCG在Ⅱ期和Ⅲ期结肠癌患者中用以免疫调节佐剂。结果显示Ⅱ期结肠癌患者的无复发间隔时间、无复发生存率和总生存率均有明显提高，但在Ⅲ期结肠癌患者中并未有明显获益[25]。

2.1.3 Cadi-05 Cadi-05是由经高压灭菌的分枝杆菌组成的TLR2激动剂，现已被证实其在体内激活抗癌免疫反应[26]。目前已开展联合Cadi-05治疗的第二阶段临床试验，与Cadi-05相似的IMM-101也是由灭活细菌组成，其联合放射治疗结直肠癌的临床试验也已经开展。

2.1.4 脂多糖(LPS) LPS 是TLR2/4的天然配体。大量的研究证实，LPS作为单一疗法或联合其他抗癌药物可以抑制小鼠模型的肿瘤生长[27]。早期的临床试验证实低剂量的LPS联合非甾体类抗炎药(NSAID)可以明显抑制结直肠肿瘤的生长。然而近期发现，LPS也可以通过调节NF-κB信号、抑制α-连环蛋白来增强CRC细胞的运动性[28]。

2.2 TLR3

TLR3作为TLRs家族中一种特殊的蛋白，其通过TLR3-Unc93b-TRIF-TRAF3途径介导免疫缺陷相关疾病(除TLR3外均由MyD88-IRAK4途径介导)，并进一步参与免疫相关肿瘤的发展。TLR3单核苷酸多态性(SNPs)与癌症的易感性相关，因此可以作为评估患癌风险的潜在生物学标志[29]。

TLR3在高、低分化腺癌和息肉病的正常结肠黏膜中表达较高，提示TLR3可能促进正常组织息肉的形成，进而导致结直肠癌的发生[29]。然而，在另一项肠息肉与结直肠癌TLRs表达相关性的研究中，并未发现TLR3表达有何差异[30]。同时还有研究发现低表达的TLR3提高了KRAS突变型结直肠癌体内肠道病毒的抗癌活性[31]。因此，还需要进一步研究来确定TLR3激动剂在结直肠癌中的作用。

2.3 TLR5

TLR5在抗肿瘤的免疫治疗中起着非常重要的作用，鞭毛蛋白是TLR5的天然激动剂，在多种肿瘤模型中发挥抗肿瘤作用。有研究发现在人结直肠肿瘤的小鼠异种移植模型中，瘤周鞭毛蛋白通过激活TLR5来抑制肿瘤生长，促进肿瘤坏死[32]。TLR5激动剂恩替莫德(CBLB502)可以保护肝脏细胞、抗细胞突变，由于TLR5主要在肠道、膀胱、肝脏中表达，全身应用其激动剂的安全性大大提高。此外TLR5介导的信号通路减少致休克炎性因子的释放如TNF-α、IL-1β和IL-2等，进一步降低了TLR5激动剂的毒性，现已联合应用于第一阶段结直肠癌放射治疗中[33]。

2.4 TLR7

TLR7在浆细胞样树突状细胞(pDC)中表达，pDC可以分泌大量INF-1来提高CD8+T细胞和NK细胞活性。研究发现，CRC患者TLR7表达水平明显降低[30]，因此TLR7低水平表达提示着结直肠组织的癌变趋势。而且TLR7多态性对利妥昔单抗治疗转移性CRC具有预测价值，TLR7激动剂咪喹莫特可以抑制结肠癌模型中的肿瘤生长，并对pDCs具有肿瘤杀伤活性[34]。此外，在结肠癌模型中还发现了852A(TLR7激动剂)和 3M-011(TLR7/8激动剂)的抗癌作用，将他们联合环磷酰胺治疗，可以增加化疗效果[35]。

2.5 TLR9

越来越多的证据表明TLR9在结直肠癌发生发展中起着重要作用。TLR9在结直肠癌患者的增生性和绒毛性息肉中的表达降低，这表明其在大肠粘膜中的表达具有潜在的预防恶性肿瘤的作用。TLR9可以识别细菌、病毒和免疫球蛋白中，包含未甲基化CpG序列的DNA片段(CpG ODN)[36]。

CpG-7909(ProMune)是临床研究中的第一个TLR9激动剂，然而它在抗肿瘤的治疗中并未有明显作用。随后实验发现CpG-1826可以抑制小鼠肝转移性结肠癌的生长，但随着其应用剂量增加，肝脾肿大的副作用也随之发生。Done等通过协同α-GalCer附载的肿瘤细胞与CpG-1826发明了新的抗肿瘤疫苗。它不但可以抑制结肠癌小鼠的肿瘤生长，还能诱导机体对肿瘤的长期记忆性免疫[37]。

MGN1703是临床研究的另一种CpG ODN化合物，在第一阶段临床试验中，无药物相关的不良反应发生，充分显示了其抗肿瘤及免疫耐受作用[38]。此外，在第二阶段试验中，经MGN1703治疗的转移性结直肠癌患者的无进展生存期与癌症病情的控制均得到了很好的改善，目前正在第三阶段的临床试验中。另一种新的TLR9激动剂C792在临床研究中也表现出明显的抗肿瘤疗效[39]。

3 MYD88抑制剂

MYD88是TLRs信号通路中重要的衔接分子之一。除TLR3外，所有TLRs的激活均由MyD88依赖性信号转导通路介导。MyD88可以募集白细胞介素-1受体相关激酶(IRAK)，使其磷酸化后活化转化生长因子激酶-1(TAK1)信号转导并磷酸化NF-κB抑制剂，促进细胞核对促炎细胞因子的表达[40]。

基于Myd88分子结构，合成了一种新化合物(TJ-M2010-5)，其可以与MyD88结合来干扰TLRs信号通路。TJ-M2010-5在氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎相关的癌症模型中减少了结肠炎的发生，从而降低癌变率。此外，TJ-M2015-5还可以减缓细胞增殖、加速细胞凋亡，抑制小鼠结肠组织中细胞因子、趋化因子和免疫细胞的生成[41]。

4 TLRs作为CRC预后的生物标志物

目前，许多学者研究了TLRs表达与CRC预后的关系，Paarnio等[42]发现在近端结肠癌中，TLR4强表达者5年生存率比弱表达者高36.9%，而TLR2表达水平与预后无关。Eiró等[43]对104例CRC患者TLRs水平进行分析，发现TLR9的表达与肿瘤学组织学分期直接相关，TLR4在成纤维细胞中的高表达可以减少肿瘤的复发。然而，Cammarota等[44]发现在腺癌患者细胞基质中TLR4的高表达预示着疾病预后不佳。此外，TCR4和MyD88在CRC中的高表达与肝转移、无病生存期和总生存期显著相关。总体而言，还需要更多的研究来证明TLRs表达与CRC预后的关系。

5 小结与展望

CRC的发病率与死亡率居各种肿瘤之首，TLRs信号通路在结直肠上皮的固有免疫与适应性免疫反应中具有重要作用。靶向这一途径的药物如BCG、MPL等已被FDA批准在不同疾病中。尤其BCG已经在第一、二阶段临床试验中使用。最近研究表明OM-174在标准治疗难以治疗的CRC中表现出良好的耐受性。越来越多的实验证实TLRs信号通路对结直肠癌的治疗作用，但其具体机制仍然需要学者们进一步研究。