应用以人转录组为靶点的shRNA文库筛选肺癌肿瘤相关抑制基因

徐 晖 李 希 周春水

肺癌的肿瘤形成是一种复杂的多因素、多步骤过程，它涉及多种遗传学及表观遗传学上的异常变化[1-3]，这些恶性表型归根结底都是控制这些生理过程的基因发生了异常改变。因此，发现并且阐明在肿瘤起源和进展中起关键作用的肿瘤抑制基因成为肿瘤防治中的中心任务，新型肿瘤相关基因的发现也为开发新型肿瘤治疗方法提供更有效、更有针对性的药物靶标[4]。

近年来发展起来的针对人转录组的shRNA文库为全基因组功能缺失性筛选提供了有力工具。shRNA文库由大量针对验证的目标基因设计的shRNA克隆组成[5-7]。通过shRNA文库及肿瘤细胞的锚定不依赖性生长特性已经在乳腺癌中筛选了包括PTPN12在内的多种肿瘤抑制基因[8]。本研究拟通过应用shRNA文库筛选肺癌相关的肿瘤抑制基因，为今后大规模、高效率的筛选更多种类的抑癌基因奠定坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 shRNA文库逆转录病毒的包装

以300万细胞/孔将GP2-293细胞接种于10 cm培养皿中。24 h后进行shRNA文库(pSM2c_shRNAmir 1.1-1.6，Hannon-Elledge 文库)转染，选取3.1～3.6亚库进行病毒包装，包装体系如下：VSVG for retro 12 μg、shRNA文库12 μg、Opti-MEM 1.5 mL、Mirus 60 μL，室温作用20 min，分别加入到GP2-293细胞中。以此时间为零点，零点之后的第48 h吸取上清(病毒在上清中)，然后再加入新鲜的培养基，零点之后的72 h吸取上清。将病毒液以800 rpm离心5 min后用0.45 μM滤膜过滤，-80℃冻存。

1.2 shRNA文库包装病毒感染BEAS-2B细胞

培养BEAS-2B细胞，将BEAS-2B细胞种六孔板，30万细胞/孔。以MOI为1加入文库包装的病毒。加入终浓度为0.5 μg/mL的puromycin筛选病毒阳性感染细胞。

1.3 软琼脂克隆形成实验筛选锚定不依赖性生长BEAS-2B细胞系

配制底层琼脂：微波炉中溶解1.6%低熔点琼脂糖，水浴锅中冷却到40℃。将2×培养基放入40℃水浴锅中。加等体积的1.6%低熔点琼脂糖与2×培养基，使琼脂糖终浓度为0.8%。将其倒入10 cm培养皿中，每个培养皿10 mL。室温冷却至凝固。配制上层琼脂：微波炉中溶解3.5%低熔点琼脂糖，并将其放入40℃水浴锅中。消化puromycin筛选的文库转染细胞，800 rpm离心5 min，细胞计数，并将细胞浓度配制成10万细胞/mL。在50 mL离心管中加入3.5%低熔点琼脂糖3 mL，BEGM培养基27 mL，细胞450 μL。每10 cm培养皿加入10 mL混合液，此时细胞数为1.5万细胞/10 cm培养皿。室温冷却至凝固。将培养皿放入37℃，5%CO2孵箱中培养3周，每三天加入1.5 mL BEGM培养基。

1.4 新肿瘤抑制基因的筛选

从软琼脂平板中挑取单个克隆放入24孔板中培养。逐渐扩大培养至6 cm培养皿中。提取细胞全基因组DNA(按照Qiagen试剂盒方法提取)。PCR扩增基因组DNA片段，根据MSCV-PM-mir30质粒序列设计通用引物，由北京英骏公司合成引物序列，如表1所示。PCR产物测序并应用Pubmed blast分析其对应的人类基因名称。

表1 MSCV-PM-mir30扩增通用引物Table 1 Primers for MSCV-PM-mir30 amplification

1.5 软琼脂克隆形成实验验证基因沉默后BEAS-2B细胞恶性转化情况

对候选基因INPP4B所在的细胞系扩大培养，细胞融合度为80%～90%时进行后续实验。配制底层琼脂及上层琼脂，方法同前所述。消化puromycin筛选的文库转染细胞，800 rpm离心5 min，细胞计数，并将细胞浓度配制成10万细胞/mL。在50 mL离心管中加入3.5%低熔点琼脂糖3 mL，BEGM培养基27 mL，细胞450 μL。每10 cm培养皿加入10 mL混合液，此时细胞数为1.5万细胞/10 cm培养皿。室温冷却至凝固。将培养皿放入37℃，5%CO2孵箱中培养3周，每三天加入1.5 mL BEGM培养基。每个10 cm培养皿加入1 mL结晶紫溶液，室温1 h，照相，计数10 cm培养皿中克隆形成数量。

1.6 细胞增殖检测

取对数生长期BEAS-2B shFF2、BEAS-2B shINPP4B沉默细胞，将其接种于96孔板中，2000细胞/孔，每种细胞接种六个复孔。接种七块相同的96孔板。24 h后取其中的一块96孔板，吸去培养基，PBS洗三次。每孔加入培养基200 μL，CellTiter96®Aqueous One Solution Reagent 20 μL，37℃孵箱孵育4 h，用酶标仪测定490 nm处的光吸收值。每天重复测定一次，共测定7次。以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线。

1.7 裸鼠成瘤实验验证基因沉默后BEAS-2B细胞恶性转化情况

对含有shINPP4B沉默基因的BEAS-2B细胞扩大培养。细胞计数，每种细胞取5×107个细胞接种裸鼠皮下，接种3周后测量肿瘤体积的大小。

1.8 统计学分析

应用SPSS 13.0软件进行分析，采用两独立样本t检验方法对克隆形成及裸鼠成瘤大小及体积进行统计学分析，MTT实验采用重复测量方差分析进行比较，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 shRNA文库转染BEAS-2B细胞软琼脂克隆形成实验

与shFF2转染细胞相比，文库转染细胞数目较多，并可形成较大的克隆。对MSCV-PM-shFF2转染细胞及文库转染细胞的软琼脂平板所形成的的细胞团(直径>1 mm)进行计数，shFF2转染细胞的克隆形成数为86±20，文库转染细胞的克隆形成数205±35，差异具有统计学意义(P=0.014)(图1)。

图1 shFF2及文库转染BEAS-2B细胞软琼脂克隆实验Figure 1 The number of colony formation between BEAS-2B cells infected with shFF2 and cells transfected with shRNA libraryNote：A.Cells transfected with shFF2；B.Cells transfected with shRNA library；C.The number of colony formation between BEAS-2B cells transfected with shFF2 and cells transfected with shINPP4B.

2.2 新肿瘤抑制基因的筛选

所插入的shRNA基因片段经PCR扩增、DNA测序后，用blast 发现其相应的靶基因并剔除重复测序基因(表2)。

表2 BEAS-2B细胞候选肿瘤抑制基因Table 2 Candidates of malignant transformation suppressors were identified in BEAS-2B cells by the shRNA library targeting transcriptome

2.3 候选基因INPP4B沉默效果检测

选取INPP4B作为候选肿瘤抑制基因。将软琼脂平板上的克隆扩大培养，Western blot验证基因沉默效果。可见shINPP4B沉默组相应基因表达量显著降低，差异具有统计学意义(P=0.008)(图2)。

2.4 软琼脂克隆形成实验验证基因沉默后BEAS-2B细胞恶性转化情况

将含有shINPP4B的BEAS-2B细胞扩大培养后，接种软琼脂平板，待细胞生长三周后结晶紫染色，照相。shINPP4B组细胞克隆数较多，体积较大。说明当INPP4B沉默后，细胞发生了恶性转化。显微镜下观察，shFF2对照组细胞零星分布于平板中，shINPP4B转染组细胞较密集，数量较多。经细胞计数，shFF2对照组、shINPP4B组分别为(205±40)个/10 cm培养皿、(618±36)个/10 cm培养皿(图3)，实验组组与对照组具有统计学差异(P=0.003)(图3)。

图2 INPP4B沉默细胞中INPP4B蛋白水平检测Figure 2 The level of INPP4B protein in BEAS-2B cells silenced with shINPP4BNote：A.The expression of INPP4B in BEAS-2B cells transfected with shINPP4B and shFF2；B.The intensity of protein INPP4B bands was quantified with a densitometry.

图3 BEAS-2B细胞软琼脂克隆形成实验Figure 3 The colony formation in BEAS-2B cellsNote：A.BEAS-2B cells transfected with shFF2；B.BEAS-2B cells transfected with shINPP4B；C.The number of colony formation between BEAS-2B cells transfected with shFF2 and shINPP4B.

2.5 MTT法检测INPP4B基因沉默后BEAS-2B细胞增殖情况

取shFF2对照组，shINPP4B沉默BEAS-2B细胞系，应用MTT实验检测细胞增殖速度，在490 nm处读取吸光度值。实验结果可见，shINPP4B沉默组细胞增殖速度均高于shFF2对照组细胞，差异具有统计学意义(P<0.001)(图4)。

2.6 裸鼠成瘤实验验证基因沉默后BEAS-2B细胞恶性转化情况

FF2对照组、shINPP4B转染组肿瘤重量分别为(0.156±0.071)g，(0.844g±0.074)g，差异有统计学意义(P=0.001)。FF2对照组、shINPP4B转染组肿瘤体积分别为(69.02±31.48)mm3，(874.56±60.80)mm3，差异有统计学意义(P<0.001)(图5)。

图4 MTT实验检测细胞增殖Figure 4 Proliferative curves of BEAS-2B cells transfected with shFF2 or shINPP4B

图5 BEAS-2B细胞裸鼠成瘤实验Figure 5 Xenografts in nude miceNote：A.The nude mouse implanted BEAS-2B cells transfected with shFF2；B.The nude mouse implanted BEAS-2B cells transfected with shINPP4B；C.The tumor weight between nude mice implanted cells with shFF2 or shINPP4B；D.The volume of tumor between nude mice implanted cells with shFF2 or shINPP4B.

3 讨论

shRNA文库一般采用的是鼠源逆转录病毒(MSCV)或慢病毒(Lentivirus)作表达载体。shRNA文库保存形式有列阵(Arrayed)文库和集合(Pooled)文库。Arrayed文库能用于高通量图像分析以及探测细胞周期变化。Pooled文库需要的试剂少，成本小，便于进行大规模、高效率功能筛选。shRNA-mir文库靶点涵盖广、基因沉默效率高，可广泛应用于体外实验进行肿瘤抑制基因的筛选。为了研究肺癌发生过程中起到关键作用的肿瘤抑制基因，我们应用shRNA文库进行肿瘤抑制基因的筛选。

哈佛大学Elledge实验室应用shRNA-mir文库和体外软琼脂细胞克隆形成这两种技术在永生化的乳腺上皮细胞中筛选出PTPN12等多个新型肿瘤抑制基因。由于不同来源的细胞基因略微有些差别，而美国乳腺癌占有很大的比例，所以哈佛大学的研究主要集中在对乳腺上皮的永生化细胞肿瘤抑制基因的筛选上。而在过去的30年，中国肺癌死亡率逐年增加，肺癌已经超过肝癌，成为癌症死亡的首要病因[9]。上海、辽宁更是肺癌高发城市。根据WHO的统计，2025年，中国新增肺癌人数将达每年100万。因此我们主要针对肺肿瘤抑制基因进行研究。我们利用研究中较常见的永生化肺支气管上皮细胞BEAS-2B，应用shRNA文库技术筛选肺上皮肿瘤抑制基因，发现了几个在肺癌过程中起到关键作用的肺肿瘤抑制基因，这在之前的研究中未见报道。

在本研究中，我们应用shRNA文库筛选技术和软琼脂克隆形成实验在肺支气管上皮细胞全基因组中分离出100个分离较好，较大的克隆，经过PCR扩增、基因组比对确定了6个肺肿瘤抑制基因候选基因，分别为INPP4B、Sesn2、TIAR、ACRC、NUP210、LMTK3。其中INPP4B已证实可能是乳腺癌及前列腺癌的肿瘤抑制基因[10-11]，但在肺癌发生中的作用未见报道。Sesn2是p53基因的靶蛋白，对mTOR通路具有负调节作用[12]。TIAR是RNA结合蛋白，对细胞凋亡、病毒复制、感染、代谢应激具有调节作用，下调TIAR蛋白的表达可促进肿瘤细胞的增殖与侵袭，有文献报道称其可能是肿瘤抑制基因[13]。ACRC的功能未知，有报道称与帕金森病有关。NUP210是210KD的核孔蛋白，其表达可能决定细胞的命运[14]。LMTK3蛋白的表达水平可影响乳腺癌对药物的敏感性，对于肿瘤内蛋白质LMTK3水平较高的患者，一些常规药物的疗效不佳，患者存活时间较短，而蛋白表达水平较低的患者，对药物的敏感性更好存活时间较长。其可能成为乳腺癌治疗的新靶点[15]。

由于本研究通过shRNA文库筛选了几个已知的肿瘤抑制基因及几个与肿瘤发生相关的基因，发现的候选基因限制肺癌细胞的锚定不依赖性生长，说明通过shRNA筛选肿瘤抑制基因的方法有效。根据已有文献的报道，我们选取了INPP4B作为肺肿瘤抑制基因的优先候选基因。

当肺支气管上皮细胞BEAS-2B沉默了INPP4B基因后，细胞在软琼脂平板上形成的克隆数较对照组克隆增大，数目增多。沉默了INPP4B基因后细胞增殖速度增快在裸鼠皮下注射后可形成较大的肿瘤，说明肺支气管上皮细胞可能发生了恶性转化，但其具体通过的机制不明，我们将在后续的实验中进行研究。我们通过shRNA文库及软琼脂克隆实验结合测序分析，初步探讨了发现肿瘤抑制基因的一种方法，为今后大规模的筛选工作奠定了基础。