西南地区HPV-6和HPV-11 E6/E7 基因多态性分析*

万秋伶，丁显平△，高 鹏，方莅媛

1.四川大学 生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室，四川大学 生命科学学院遗传医学研究所(成都 610065)；2.特色生物资源资源研究与利用川渝共建重点实验室(四川 610064，重庆 408400)；3.重庆特色生物产业技术创新研究院(重庆 408400)

人乳头瘤病毒6型(HPV-6)和11型(HPV-11)，通常被认为是“低危型”HPV，可引起黏膜感染，导致潜在致命疾病感染，如恶性喉癌或恶性喉乳头状瘤[1-2]。 HPV-6和HPV-11诱导的黏膜感染可引起尖锐湿疣，往往会引起负面影响，对医疗保健系统和患者是一个重大负担，给患者带来严重的心理困扰[3-4]。在结构上，HPV是双链环状DNA病毒，编码“早期”(E包括E1、E2、E4、E5、E6和E7)和“晚期”(L包含L1和L2)蛋白[5-6]。在HPV编码的蛋白质中，E6和E7已被证明是重要的致病性HPV蛋白，严格调节HPV诱导的肿瘤发生[7-8]。然而，“低危型”HPV E6和E7蛋白可能导致恶性进展的分子机制尚不完全清楚[9]。因此，本研究结果可能对理解内在的地理相关性和生物学差异具有重要意义，为HPV-6和HPV-11的预防、诊断及治疗，甚至基于HPV蛋白E6和E7的治疗性疫苗的设计研究提供重要数据。

1 材料与方法

1.1 样品收集

选取2015～2017年在四川省生殖健康研究中心专科医院、成都安琪儿妇产医院、成都阳光医院及西南地区部分医院接受HPV筛查的患者，收集228例HPV-6/HPV-11阳性标本(男性取一定大小的疣体组织，置于生理盐水中，女性取宫颈分泌物置于宫颈保存液中)。医师联合采集，标本采集时已征得患者知情同意。样品置于-20 ℃下保存直至DNA提取。

1.2 试剂与仪器

DNA基因测序分析仪(Applied Biosystems,3500,DNA Genetic Analyzer)，PCR扩增仪(北京东胜科学仪器有限公司)，微量移液器(上海大龙医疗设备有限公司)，生物安全柜(安徽航天生物科技有限公司) ， GSG-2000核酸/蛋白凝胶图像分析系统(珠海黑马医学仪器有限公司) ，HPV基因分型提取检测试剂盒(亚能生物技术有限公司)，10×PCR缓冲液(Mg2+)，2.5 mM dNTPs，2U Taq DNA聚合酶。

1.3 实验方法

1.3.1 引物设计 引物设计参考序列为 Genbank No：X00203和No: M14119(表1)。

表1 HPV E6/E7 PCR引物设计

1.3.2 DNA提取 根据制造商说明，使用低风险HPV基因分型实时PCR试剂盒(亚能生物，中国)进行DNA提取。首先，移取1 mL分泌物，置于1.5 mL离心管中。其次，将细胞悬浮液在微量离心机中以13 000 r/min，离心半径6 cm，离心5 min，保留沉淀物，加入100 μL煮沸10 min的核酸提取物。 最后，上清液准备通过实时PCR扩增。

1.3.3 PCR扩增 片段的扩增在25 μL反应体积中进行，其中含有10×PCR缓冲液(Mg2+)，2.5 mM dNTPs，2U Taq DNA聚合酶，90 pmol引物。 PCR扩增由以下条件组成：95 ℃初始5 min变性，39个扩增循环，每个循环包括94 ℃变性45 s，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸60 s；最后72 ℃保存5 min。所有扩增的HPV-6/HPV-11 E6和E7 DNA产物均在含有溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳中检测，并送至上海生工有限公司进行测序。

1.4 E6和E7基因序列分析

所有数据均通过重复PCR扩增和序列分析至少两次来确认。随后用NCBI BLAST，DNAMAN版本5.2.2和Primer Premier 5 分析序列和变体。HPV-6 DNA核苷酸突变根据HPV-6参考Genbank序列(No：X00203)进行对比，HPV-11 DNA核苷酸突变根据HPV-11参考Genbank序列(No：M14119)进行对比。MEGA软件(http://www.megasoftware.net/home)被用来构建系统发育树，针对HPV E6和E7不同的突变株。收集已发表的国内外不同地区的HPV序列作为制作进化树的参考序列。

1.5 选择压力分析

通过使用PAML 4.8软件(codeml工具)进行似然比检验(likelihood ratio tests，LRT)，以推断非同义/同义核苷酸分歧。使用朴素经验贝叶斯(NEB)方法，用后验概率P≥0.99识别正向选择的位点，预测可能受到正向选择的HPV-6/11 E6和E7 基因序列中的位点[10-11]。

2 结果

2.1 PCR扩增

PCR扩增的产物均在含有溴化乙锭的琼脂糖凝胶中进行电泳分析，检验扩增的效果，观察电泳所跑出的目的条带，均有清晰条带出现，筛选出的HPV阳性样本有相应的目的条带出现(图1)。

图1 琼脂糖凝胶电泳图

注：A:HPV-6 E6/E7;B:HPV-11 E6/E7；DNA Marker I/DNA Marker II

2.2 HPV-6 E6 序列分析

将123个HPV-6 E6基因序列与GenBank HPV-6参考序列(X00203)进行比较，鉴定出7个多态性位点(G40T，A120T，C150G，A222T，A264T，C291T，G372A)。其中突变G40T(D14Y)，C150G(H50Q)会导致氨基酸发生突变，非同义突变D14Y发生在编码HPV-6 α螺旋的区域内。5个属同义突变(A120T，A222T，A264T，C291T，G372A)。值得注意的是，120位的A-T突变率和372位的G-A突变率是100%。

HPV6 E6序列的贝叶斯系统进化树，出现4个分支(图2)。从突变株数据也可以发现，只有3种类型的突变株被鉴定出来，黑正方形的变异株是参考突变株，说明E6基因具有高度的保守性。其中突变株HPV6 E601也是数量最多的突变株，与参考序列最接近，同源性达到了94%，说明这个分离株很有可能来源于参考序列(X00203)。

图2 HPV6基因E6的贝叶斯系统进化树

2.3 HPV-6 E7 序列分析

与参考序列(X00203)相比，所研究的123个E7 HPV-6序列中的核苷酸变异率为34.15%，共鉴定出5个单核苷酸变化(A10G，G11A，G100A，T155A，C294A)，其中A10G(R4E)、G11A(R4E)、G100A(E34Q)、T155A(F52Y)是非同义的，C294A是同义突变。 最常见的非同义序列突变T155A，此位点在编码链中发生F52Y(苯丙氨酸至络氨酸)氨基酸的变化。 在分析的E7 HPV-6变体中未鉴定出插入、缺失或过早终止密码子。

HPV6 E7序列的贝叶斯系统进化树，共5个分支，被鉴定出来的3个类型分离株在3个分支上面，分离株HPV6E701没有找到对应的亚型，或许是1个新的分支；由于该类型分离株的数量较少，所以朝这个方向进化E7也应该很少(图3)。

图3 HPV6基因E7的贝叶斯系统进化树

2.4 HPV-11 E6 序列分析

与HPV-11参照序列(M14119)相比，在108个HPV-11 E6基因序列中显示序列多态性发生在4个核苷酸位置(T63C、T22C、C279T、G365A)。 且只存在1个非同义突变G365A(G122E)，仅占一小部分(7.5%)。第63个碱基中T至C的突变频率为100%。 此外，非同义突变编码α螺旋，通过比对来自所有病毒株的E6 核苷酸序列,分析HPV-11 E6序列,不存在插入和缺失事件。HPV11 E6序列的贝叶斯系统进化树，共3个分支，被鉴定出来的3个类型分离株在3个分支上面，均找到相对应的亚型(图4)。

图4 HPV11基因E6的贝叶斯系统进化树

2.5 HPV-11 E7序列分析

与HPV-11参考序列(M14119)相比，E7的核苷酸变异率为88.8%。在297 bp E7 开放阅读框中仅鉴定出1个单核苷酸变化(G133T)，是非同义的(A45S)。 E7的序列变异性低于E6。 G133T占较大比例(88.8%)，导致氨基酸A45S(从丙氨酸到丝氨酸)的变化。 但蛋白质二级结构没有改变，仍然是α螺旋。在所研究的HPV-11 E7变体中没有核苷酸缺失或过早终止密码子的证据，也不存在插入和缺失，HPV11 E7序列的贝叶斯系统进化树发现，HPV11 E7基因呈现高度保守性(图5)。

2.6 选择压力分析

鉴定HPV-6/11的E6和E7 基因序列进行选择压力分析，结果总结如下(表2)。在HPV-6 E6及HPV-11 E6、E7序列中未鉴定出正向选择的位点；然而，在HPV-6 E7变体中鉴定出正向选择位点R4E、E34K和F52Y。

图5 HPV11基因E7的贝叶斯系统进化树

模型对数似然差异 参数估计2△l正向选择位点6-E6 M7-662.94P=12.390 37 q= 99.000 00不允许6-E6 M8-662.94p0=0.999 99 P=12.389 52 q= 99.000 000无p1= 0.000 01 w=1.000 00P=16-E7 M7-436.09P= 1.367 32 q= 0.005 00不允许6-E7 M8-433.89p0=0.939 31 P= 0.005 00 q= 8.823 474.404R∗∗, 34E∗∗, 52F∗∗p1=0.060 69 w=29.562 83P<0.0111-E6 M7-643.67P=23.150 88 q= 99.000 00不允许11-E6 M8-643.670无11-E7 M7-410.18P=2.494 53 q= 0.005 00不允许11-E7 M8-410.000无

注：2Δl表示两个模型之间对数似然差的两倍

3 讨论

本研究对来自中国西南地区231例HPV-6/11分离株的E6和E7 开放性阅读框架进行了测序，以评估该群体中的HPV-6/11遗传多样性。鉴定了7种HPV-6 E6序列变体，其中的H50Q在30.08%的HPV-6序列中被鉴定出来，原型HPV-6 E6癌蛋白50位的氨基酸可能位于两个内部锌离子结合基序之间的中心，这对于E6蛋白稳定性非常重要[12-13]。这些变种以前没有在中国西南地区发现过，它们的功能影响需要进一步分析。总体而言，HPV-6 E6序列在分析的患者队列中显示高度保守，同样，鉴定了5种HPV-6 E7变体，其中4种表现出相应的E7氨基酸变化。最常见的E7 HPV-6突变是T155A和C294A。值得注意的是，T155A突变影响了34.15%(42/123)患者，并导致F52Y(苯丙氨酸至酪氨酸)氨基酸转化，预计会影响蛋白质的二级结构。尽管如此，对于HPV-6 E6、E7序列在患者队列中显示高度保守，它们在HPV-6结构和功能中发挥重要作用，与国外专家先前研究[14-15]一致。因此，它们可能也是HPV-6引物设计和诊断检测的有希望的靶标。在HPV-11 E6中观察到的常见突变是T63C，在HPV-11 E7中是G133T， 而HPV-11 E6中最常见的非同义突变是G365A。 当选择E6 / E7作为引物设计或诊断检测的靶标时，这些突变可能被认为是重要的[16]。本研究分析以评估HPV-6/11 E6和E7序列是否受到正向选择，正向选择的主要特征是它导致等位基因频率异常快速上升，从而使物种能够迅速适应环境变化[17]。在HPV-6 E6和HPV-11 E6 / E7序列中未鉴定出正向选择位点，鉴于其在患者群组中的高水平保守性，这是不足为奇的。相反，检测到HPV-6 E7序列在变体位点4R**、34E**和52F**处受到正向选择，这表明这些位点可能具有进化意义，并赋予生存优势。所有临床样本均来自中国西南地区，具有强大的区域代表性。发现了几个新的突变，这将为与中国西南地区人群有关的治疗性疫苗的开发提供真实有效的证据。因此，本研究结果扩展了目前中国西南地区HPV-6/11遗传多样性的知识，也为HPV-6/11流行病学、进化、功能、发病机制和使用的未来研究提供了宝贵资源。