高中生物疑难问题集萃

【疑问1】甲基绿和派若宁（吡罗红）染色的具体原理是什么？

Bracher于上个世纪40年代建立了甲绿-派若宁染色以来，一直是对比显示DNA和RNA分布的经典染色方法，广泛应用于教学、科研和临床诊断。

染色原理：甲绿（Methyl green甲基绿）和派若宁属于碱性染料且在水中电离后均为带正电荷的染料，甲绿带有两个正电荷，派若宁则带有一个正电荷。DNA和RNA都有磷酸基和碱基，为两性电解质，有一定的等电点。染色中两种染料通过竞争性作用分别与相应的核酸成分结合。

碱性较强的甲基绿与DNA反应（pH为3.8～4.2）使两个正电荷间的距离与DNA的磷酸基间的距离相当（见图），每个甲基绿分子中两个带正电荷的氮原子分别与DNA分子双链之中每条链的每一螺旋中的一个磷酸根相结合，这就是两者结合的基础[1]。甲基绿与DNA结合关键在于DNA分子的双螺旋空间构型的完整性，只要双螺旋构型略有改变，立即引起甲基绿与DNA的结合能力降低。

碱性较弱的派若宁与RNA结合（pH为4.6～5.2）也正好符合RNA的聚合度范围。也有人提出：甲绿-派若宁染色与DNA和RNA的聚合程度有关。甲绿对聚合程度高的DNA有较强的亲和力，而吡罗红对聚合程度低的RNA有亲和力。

图 甲基绿和派若宁分子结构

【疑问2】甲基绿和吡罗红能不能单独使用以鉴定DNA和RNA呢？

教材中提到的甲基绿和吡罗红混合染色剂指的是A液20 mL（甲基绿和吡罗红水溶液）和B液80mL（醋酸缓冲液，pH=4.8的溶液）配制的混合染色液。教材中同时使用甲基绿和吡罗红混合染色剂的意图是将细胞染色，并可同时显示DNA和RNA在细胞中的分布，从而形成对比达到实验目的。

根据甲基绿和吡罗红染色原理可知，二者可以单独去鉴定、提纯DNA或RNA。若单独使用会分别将他们染成绿色或红色，但是无法显现出DNA和RNA在细胞中的分布情况。

【疑问3】为什么甲基绿和吡罗红混合染色剂为pH=4.8左右？

醋酸和醋酸钠缓冲液的pH约为4.8左右，在此pH条件下能够保持DNA分子的空间结构，稳定甲基绿和吡罗红染色剂的结合能力。若pH偏高或偏低均会对DNA和RNA的结构造成一定的破坏，从而对染色效果有一定的影响。

【疑问4】为何选用浓度为8%的盐酸？

根据人教版教材必修1第26页内容可知，盐酸的作用是加速染色剂进入细胞，同时使染色质中的DNA与蛋白质分离，有利于与染色剂结合。而教材中提出的染色液最佳pH约为4.8左右，盐酸浓度可能为本实验的关键影响因素，如：盐酸浓度过高，或者冲洗装片不彻底等因素均会导致pH低于4.8，从而影响观察的效果。

新疆师范大学生命科学院王佳等人做过相关的探究实验：不同盐酸浓度对细胞核染色效果的影响[2]，相关内容见表：

表 不同条件下人的口腔上皮细胞染色现象

通过上述实验结果可以看出，教材提出的8%的盐酸浓度染色效果不是最佳，反而是2%的盐酸浓度染色效果更好，可能的原因是8%的盐酸浓度使pH过低，导致DNA发生酸水解，同时北京第一中学的李鑫也做了此改进实验的探究[3]：在不使用盐酸水解，直接染色的条件下，实验效果也比较理想。