高良姜醇提物的抗氧化、酶抑制活性及其与活性成分的相关性

李 姣 张晓峰 王霄凯 王婉愉

(郑州大学公共卫生学院，河南 郑州 450001)

高良姜是姜科山姜属植物高良姜 (AlpiniaofficinarumHance) 的干燥根茎，也称为高凉姜、佛手根、小良姜、良姜，主要生长于广东、广西、福建、云南等地[1]，为药食同源植物。国内外研究[2-3]表明，高良姜具有抗菌镇痛、抗炎、抗肿瘤、抗增殖、抗氧化、抗腹泻等多种生理功能，也可作为抗氧化剂应用于食品的贮藏[4]，已被应用于食品调味料、香料和保健品等方面[5-6]。

氧化应激是指机体新陈代谢过程中活性氧和活性氮的产生与清除失衡，导致活性氧和活性氮产生过多，造成机体组织细胞和生物大分子损伤，是许多疾病发生的重要因素[7]，因此提高机体抗氧化能力有助于维持机体的健康水平。多酚和黄酮类化合物是高良姜中的主要生物活性成分之一[8]。研究[9-10]表明植物多酚能降低机体活性氧水平，并可通过抗炎、抗诱变和抗血栓等功能促进机体健康。黄酮是多酚类化合物家族中非常重要的成员，同样具有抗氧化及抗肿瘤等方面的功能。胰脂肪酶与α-葡萄糖苷酶均为消化吸收过程中的关键酶，在机体的许多代谢过程中发挥着重要作用，与肥胖、糖尿病、动脉硬化等由机体代谢失调引发的疾病有密切关系[11]。若对二者酶活性进行抑制可减少机体对膳食碳水化合物和脂类的消化吸收，从而达到防治代谢相关疾病的目的。

目前高良姜的相关研究主要集中在组分提取、分离鉴定以及抑菌[12]、抗炎[13]和抗肿瘤方面[14]，而对胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的研究较少。王辉等[15]仅对高良姜不同部位乙醇提取物的α-葡萄糖苷酶活性抑制作用进行研究。本研究拟以高良姜为原料，通过对其甲醇提物中多酚和总黄酮含量、抗氧化活性以及对胰脂肪酶与α-葡萄糖苷酶的抑制活性的测定，探讨高良姜体外抗氧化活性及其在调节糖脂代谢方面的能力，以期为高良姜的进一步开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

新鲜高良姜：市售，经郑州大学药学院中药教研室教授鉴定为姜科植物高良姜。

1.2 试剂及仪器

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼 (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)、2,2’-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐[2,2’-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonate)，ABTS]、2,4,6-三(2-吡啶基)三嗪 [2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine，TPTZ]、α-葡萄糖苷酶 [酶活力≥10 U/mg]、胰脂肪酶(酶活力30～90 U/mg)：分析纯，美国Sigma公司；

槲皮素、没食子酸 (gallic acid, GA)、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷 (4-Nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG)、Tris-HCl：分析纯，上海阿拉丁试剂公司；

其他试剂：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；

真空冷冻干燥机：LGJ-18B型，北京四环科学仪器厂有限公司；

电热鼓风干燥箱：10-2BS型，天津市华北实验仪器有限公司；

旋转蒸发器：RE-2000型，上海亚荣生化仪器厂；

台式离心机：5424R型，艾本德中国有限公司；

多功能微孔板读数仪：Spectra Max M2e型，美谷分子仪器有限公司；

电子分析天平：AL204 型，梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品甲醇提取物的制备 将新鲜高良姜放于冷冻干燥机中冻干，粉碎过筛(60目)，使用CCl4在通风橱中脱脂[1∶10 (g/mL) ] 24 h，抽滤晾干。称取15 g脱脂干粉，加150 mL甲醇，浸提24 h后抽滤；重复浸泡2次，滤液合并浓缩冷冻干燥。称取冻干粉0.5 g，加1 mL甲醇配成500 mg/mL样品提取液，4 ℃储存。

1.3.2 多酚和总黄酮含量的测定 多酚含量的测定参照Ainsworth等[16]的方法，结果以每克干粉所含的没食子酸当量 (mg GAE /g DW) 表示。总黄酮含量的测定根据Arvouet-Grand等[17]的方法，并修改如下：取100 μL待测提取液并梯度稀释，加入等量的2% AlCl3甲醇溶液，25 ℃静置10 min，于415 nm波长处测量吸光度，最终以每克干粉所含的槲皮素当量 (mg QE /g DW) 表示。

1.3.3 抗氧化活性的测定

(1) DPPH自由基清除能力的测定：参照Cheng等[18]的方法，DPPH自由基离子的清除率按式(1)计算。

(1)

式中：

c—— DPPH自由基离子清除率，%；

m1—— 100 μL DPPH溶液+100 μL样品液的吸光度值；

m2—— 100 μL甲醇溶液+100 μL样品液的吸光度值；

m0—— 100 μL DPPH溶液+100 μL甲醇溶液的吸光度值。

(2) ABTS自由基清除能力的测定：参照Ali等[19]的方法，并对ABTS自由基离子清除率计算公式稍作修正，见式(2)。

(2)

式中：

c—— ABTS自由基离子清除率，%；

m1—— 180 μL ABTS+·工作液+20 μL样品液的吸光度值；

m2—— 180 μL乙醇溶液+20 μL样品液的吸光度值；

m0—— 20 μL乙醇溶液+180 μL ABTS+·工作液的吸光度值。

(3)铁离子还原能力的测定：参照Sreerama等[20]的方法，结果用每克样品干重中相当于Fe2+的微摩尔数 (μmol Fe2+/g DW)值表示。

1.3.4 代谢关键酶抑制活性的测定

(1) 胰脂肪酶抑制活性的测定：参照Mcdougall等[21]的方法，并修改如下：于1.5 mL离心管中加入50 μL样品提取液并梯度稀释，再加150 μL酶工作液与350 μL 0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液 (pH=8.2)，37 ℃预热10 min 后加入450 μL底物工作液，37 ℃下反应2 h。反应终止后，16 000 r/min离心3 min，移取300 μL上清液至96孔板，测定405 nm波长处的吸光度。胰脂肪酶活性的抑制率按式(3)计算。

(3)

式中：

c—— 胰脂肪酶活性抑制率，%；

m1—— 50 μL样品液+150 μL酶工作液+350 μL Tris-HCl缓冲液+450 μL底物工作液的吸光度值；

m2—— 以150 μL Tris-HCl缓冲液替代酶工作液的吸光度值；

m3—— 以50 μL甲醇替代样品液的吸光度值；

m4—— 以50 μL甲醇替代样品液，150 μL Tris-HCl缓冲液替代酶工作液的吸光度值。

(2)α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定：参照Kang等[22]的方法，α-葡萄糖苷酶活性的抑制率按式(4)计算。

(4)

式中：

c——α-葡萄糖苷酶活性抑制率，%；

m1—— 8 μL样品液+20 μL酶工作液+112 μL PBS缓冲液+20 μL底物工作液的吸光度值；

m2—— 以20 μL PBS缓冲液替代酶工作液的吸光度值；

m3—— 以8 μL甲醇替代样品液的吸光度值；

m4—— 以8 μL甲醇替代样品液，以20 μL PBS缓冲液替代酶工作液的吸光度值。

1.4 数据分析与统计

采用Microsoft Excel 2016对数据进行整理，使用SPSS 21.0软件进行单因素方差分析。所有试验均重复3次，结果以平均值和标准差表示。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 高良姜醇提物中多酚与总黄酮的含量测定结果

2.1.1 高良姜醇提物中多酚的含量 由图1 可知，当质量浓度在0～250 μg/mL时，没食子酸与吸光度值的线性关系较好。测得高良姜醇提物中多酚含量为62.91 mg GAE/g DW。

2.1.2 高良姜醇提物中总黄酮的含量 如图2所示，当质量浓度在0～200 μg/mL时，槲皮素与吸光度值的线性关系较好。测得高良姜醇提物中总黄酮含量为13.12 mg QE/g DW。

2.2 高良姜醇提物的抗氧化活性

2.2.1 DPPH自由基清除能力 高良姜醇提物对DPPH自由基清除能力如图3所示。由图3可知，高良姜醇提物浓度在6.25～50.00 mg/mL时，其对DPPH自由基的清除能力随着浓度的增大而增大(Y=23.053lnX+7.307 8，R2=0.98，P<0.01)，且各浓度的清除率之间的差异有统计学意义(P<0.05)。当高良姜醇提物浓度达到50 mg/mL 时，其对DPPH自由基的清除率达到最大值95.78%。醇提物的对DPPH自由基的半抑制浓度IC50值为6.37 mg/mL。若IC50值≤10 mg/mL，可以认为该物质的抗氧化功能较好[23]，因此高良姜醇提物对DPPH自由基离子的清除能力较强。石雪萍等[24]的研究同样发现高良姜总黄酮具有DPPH自由基清除活性，且抗氧化能力呈质量浓度依赖性。

图1 没食子酸标准曲线Figure 1 Standard curve of GA

图2 槲皮素标准曲线Figure 2 Standard curve of quercetin

不同字母表示差异显著(P<0.05)

2.2.2 ABTS自由基清除能力 高良姜醇提物对ABTS自由基清除能力如图4所示。由图4可知，高良姜醇提物浓度在1.56～50.00 mg/mL时，其对ABTS+·的清除能力随着浓度的增大而增大(Y=18.394lnX+37.751，R2=0.89，P<0.01)，在高良姜醇提物浓度达到25 mg/mL 时，对ABTS+·的清除能力达到98.47%，之后随浓度的增长其清除能力趋于平稳。醇提物的对ABTS自由基的半抑制浓度IC50值为2.24 mg/mL，说明醇提物对ABTS自由基的清除能力较强。Köse等[25]分别使用水和乙醇对高良姜进行提取，结果显示2种提取物均表现出了ABTS自由基离子的清除能力，但乙醇提物的自由基离子清除能力较强。

不同字母表示差异显著(P<0.05)

2.2.3 铁离子还原能力 以FeSO4浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制FeSO4标准曲线。如图5所示，浓度在0～1 000 μmol/L时FeSO4浓度与其在593 nm处的吸光度呈良好的线性关系。高良姜醇提物的FRAP值为428.92 μmol Fe2+/g DW。

2.3 高良姜醇提物对代谢关键酶的抑制活性

2.3.1 胰脂肪酶抑制活性 高良姜醇提物对胰脂肪酶的抑制活性如图6所示。从图6可知，高良姜醇提物对胰脂肪酶具有较好的抑制活性，当浓度为62.5 mg/mL时，对胰脂肪酶的抑制率较低 (12.42%)，但随着浓度的增大，其抑制活性逐渐增强，IC50值为205.87 mg/mL。曲线回归分析表明在此浓度范围内，对胰脂肪酶抑制活性呈现质量浓度依赖性(P<0.05)。

图5 FeSO4标准曲线Figure 5 Standard curve of FeSO4

图6 高良姜醇提物对胰脂肪酶抑制活性Figure 6 Pancreatic lipase activity Inhibition of methanol extract of Galangal

2.3.2α-葡萄糖苷酶抑制活性 高良姜醇提物对α-葡萄糖苷酶抑制活性如图7所示。由图7可知，高良姜醇提物浓度在62.50～500.00 mg/mL时，对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率随着质量浓度的增大而增大，IC50值为1.32 mg/mL，说明在此浓度范围内高良姜醇提物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用与提取物浓度有明显的相关性，并且各浓度下的α-葡萄糖苷酶抑制率之间的差异有统计学意义(P<0.05)。

图7 高良姜醇提物对α-葡萄糖苷酶抑制活性Figure 7 α-glucosidase activity inhibition of methanol extract of Galangal

已有研究表明姜科植物在降糖方面具有较好功效，如生姜[26]、姜黄[27]、草果[28]等在胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶活性抑制方面都有较强的功能，表现出了较好的降血脂、抗糖尿病效果。本研究也发现姜科植物高良姜表现出较好的胰脂肪酶、α-葡萄糖苷酶抑制活性，且均呈现一定的浓度依赖性。

2.4 高良姜醇提物生物活性与其多酚和总黄酮含量的相关性分析

为进一步探讨高良姜醇提物的抗氧化能力和酶抑制功能来源，本试验对高良姜醇提物抗氧化能力、胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性与其多酚、总黄酮含量的相关性分析结果见表1。

表1高良姜醇提物生物活性与其多酚、总黄酮含量的相关性分析†

Table 1 Correlation analysis between bioactivities and polyphenols and flavonoids of methanol extract of Galangal

自由基及酶相关系数 r多酚总黄酮DPPH+·清除能力0.992∗0.968∗ABTS+·清除能力0.996∗0.927∗铁离子还原能力(FRAP)0.941∗0.887∗α-葡萄糖苷酶0.976∗0.858∗胰脂肪酶0.990∗0.942∗

† *表示有统计学意义(P<0.05)。

由表1可知，高良姜醇提物多酚和总黄酮含量均与其3种抗氧化指标、胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性呈正相关 (P<0.05)，说明高良姜醇提物的体外生物学活性与其多酚、总黄酮含量有密切联系。多酚和黄酮可能是高良姜醇提物中具有抗氧化活性、胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性成分的重要组成部分。

3 结论

作为药食两用的植物资源，高良姜醇提物中多酚和总黄酮含量丰富，在测定的质量浓度范围内，高良姜醇提物清除DPPH和ABTS自由基能力以及铁离子还原能力较好，对胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性随质量浓度的增高而增大。说明高良姜醇提物具有较好的抗氧化活性和代谢关键酶抑制活性，在天然抗氧化剂、降血糖降血脂药物以及功能性食品的开发与应用方面具有很好的前景。但本试验尚未对醇提物做进一步的分离鉴定，其发挥功能的主要成分有待进一步研究。