燕窝多元素的分布及溯源信息研究

马雪婷 张九凯 陈 颖 梁金钟王 楠 马秀丽 郭波莉

(1. 哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江 哈尔滨 150076；2. 中国检验检疫科学研究院，北京 100176；3. 中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193)

商品燕窝(Edible bird’s nest, EBN)本质上是雨燕科产燕窝的金丝燕(Aerodramus属)舌下腺分泌的唾液固化后形成于燕屋或天然洞穴峭壁的一种高值动物源性滋补品[1]。前人[2]54-60研究发现，质量上乘的官燕燕盏是由爪哇金丝燕(Aerodramusfuciphagus)及其亚种淡腰金丝燕(Aerodramusfuciphagusgermani)生产的，而且燕屋的开发利用极大地提高了官燕的产量，可以说目前市场上绝大多数的官燕都是采自人造燕屋的屋燕(House EBN 或 Farmed EBN)。对于采自天然洞穴岩壁的洞燕来说，其物种来源不仅包括爪哇金丝燕还包括生产毛燕的大金丝燕(Aerodramusmaximus)及其亚种(Aerodramusmaximuslowi)和生产草燕的白腹金丝燕(Collocaliaesculenta)[2]4-7[3-4]。

燕窝自古就被冠上了滋补品的标签，其中表皮生长因子[5]、唾液酸、人体必需氨基酸、矿质元素、维生素B1、牛磺酸[5]、糖蛋白等成分的发现很好地诠释了燕窝诸多的生物功效，如促进表皮生长[6]、滋阴养肺、化痰止咳、抗氧化[7]、抗病毒[8]、延缓衰老[9]、保护软骨组织等[10]。据统计[11]，2016年中国大陆燕窝年消费量达500 t，年销售额达200亿元人民币，且中国流通领域的燕窝几乎全部进口于燕窝最大的两个出口国：印度尼西亚和马来西亚。鉴于燕窝禽类制品的特殊性以及消费者对燕窝真实信息所享有的知情权，燕窝溯源技术研究的开展可以从根本上解决燕窝来源的鉴别问题，从而可以杜绝燕窝标签的不实宣传，同时为流通领域燕窝的召回提供技术支撑。针对燕窝中营养成分，有学者[12-13]开展了燕窝中矿质元素分析研究，并取得了一些进展。Marcone[14]发现燕窝中含有2.1%的灰分并应用原子吸收技术在燕窝中发现了重要的营养元素K、Ca、Mg、Fe，其中白燕窝含有较高的Ca而红燕窝含有较高的Fe。随着电感耦合等离子体技术的出现，电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)和ICP-MS先后被应用于燕窝中多种元素的分析，发现燕窝普遍含有较高含量的K、Na、Ca、Mg 4种常量元素和Fe、Cu、Zn、Mn、Cr等多种微量元素[15-17]。赵斌等[18]利用ICP-MS技术对燕窝中20种元素进行了聚类分析，发现这20种元素在红、白、黄燕窝之间的差异并不显著。Seow等[19]利用燕窝中的K、Na、Ca、Mg的分布情况实现了对24个马来半岛屋燕和24个洞燕(采自东马来和苏门答腊岛)100%鉴别。然而，还未有利用多元素分布情况对燕窝产地及采收溯源信息进行系统、详实的研究报道。为此，本研究拟以马来西亚和印度尼西亚的屋燕和洞燕为研究对象，采用ICP-MS技术对燕盏中多种元素的分布进行分析，并结合燕窝产地、采收方式相关的背景信息对具有溯源特性的数据进行挖掘，以期筛选出对进口燕窝产地及采收方式溯源具有指导意义的变量，为实现基于元素分析和化学计量学模型的燕窝溯源及营养功能开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

本研究搜集了24个马来西亚燕盏和24个印度尼西亚燕盏，其中屋燕燕盏34个，洞燕燕盏14个(由中国城市农贸中心联合会燕窝市场专业委员会、中国检验检疫科学研究院HACCP中心提供)。参照王凤云等[3]报道的DNA条码方法对所有燕盏样品的物种来源进行了鉴定，物种来源均为爪哇金丝燕Aerodramusfuciphagus。

硝酸：MOS级，北京化学试剂研究所；

双氧水：分析纯，北京化学试剂研究所；

ICP-MS内标样品(1 ng/L，part#5183-4680)：美国Agilent公司；

GBW(E)080684大米粉成分分析标准物质：国家标准物质中心。

1.1.2 主要仪器设备

电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)：7700型，美国Agilent公司；

微波消解仪：MARS 5型，美国CEM公司；

纯水机：Mill-Q型，美国Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 样品消解 在样品消解前，每个样品取约1 g置于烘箱中(60 ℃)烘至恒重(约15 h)，取出放凉置于干燥器中密封保存。参照Zhang等[20]的消解方法，准确称取0.25 g 样品于消解管中，加入6 mL硝酸浸泡2 h后，加入2 mL 双氧水浸泡0.5 h。在1 600 W功率下将微波消解仪以15 ℃/min 上升到120 ℃并保持2 min后，以8 ℃/min 上升到160 ℃并保持5 min，再以4 ℃/min上升到180 ℃并保持15 min。冷却20 min后，用去离子水将消解管中的样品转移至酸浸泡过的聚乙烯瓶中并定容至100 mL，待分析。

1.2.2 元素分析方法 以72Ge、115In和209Bi为内标，利用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)的在线内标法对不同来源燕窝中的B、Na、Mg、Al、P、K、Ca、V、Cr、Mn、Fe、Co、Cu、Zn、Se、Rb、Sr、Mo、Cs、Ba、La、Ce、Nd、Tb、Lu、Pt、Pb 27种元素进行分析。采用外标法对27种元素进行定量，当内标元素的相对标准偏差>5%时需要重新测定。同时以GBW(E)080684大米粉成分分析标准物质为参考标准物质对操作全过程进行质控。ICP-MS参数：入射功率1 280 W；冷却气流速1.47 L/min；雾化室温度2 ℃；载气(氩气)流速和辅助气流速均为1 L/min；采样深度8 mm。

1.2.3 数据统计分析方法 利用IBM SPSS Statistics Version 20软件对数据进行频率分析、Shapiro-Wilk检验、t-检验、Mann-Whitney U检验、双因素方差分析、Pearson相关分析和Spearman相关分析等统计分析。采用比率分析对各元素的中位居中变异系数(COV)进行计算，分母为设置的新变量K=1。

2 结果与分析

2.1 燕窝中元素分布

首先利用Shapiro-Wilk检验对27种元素分布的正态性进行了分析，结果发现Pt元素在燕窝中呈正态分布，其他元素呈偏态分布(表1)，因此分别以均值和中位数对Pt及其它26种元素的分布进行描述。由27种元素的含量可以看出，燕窝中富含K、Na、Ca、Mg、Fe、Al、P、Cu等多种矿质元素，其中含量最高的前5个元素均为人体必需的大量元素且含量由高到低的顺序为Na>Ca>Mg>K>P，通过比较发现这个规律与多数前人[12-13,15,18]研究结果一致。根据这5个常量元素的Pearson相关分析发现，燕盏中Ca含量与Na含量极显著负相关(-0.742，双侧P<0.01)，同时Ca含量又与Mg含量极显著正相关(0.754，双侧P<0.01)，P与其他4个元素均不相关。这就说明对于独立的燕盏个体来说，Ca与Na的含量高低顺序可能会发生变化，这一规律在他人[14,21-22]的研究中也是得到证实的，Ca与Mg的含量高低顺序不会改变。在燕窝中含有的生物体必需微量元素如Fe、Cu、Zn、Mn、Mo、Co、Se、Cr中，Fe的含量通常最高。除此之外，在燕窝中还发现了5种稀土元素，其中3种痕量的轻稀土La、Ce、Nd(<0.02 μg/g)和微量的重稀土Tb、Lu(<2 μg/g)。利用SPSS 20.0对27种元素在不同来源燕窝中分布的中位居中变异系数(Coefficient of Variance，COV)进行了分析，Sr、Ce、Cr、Fe、La、Al、Ba、V、Pb等元素在燕窝中的COV均>400%，其中Sr的最大达到了2 142%，说明一些重要的因素可能对元素在不同来源燕盏样品间的分布造成了影响。

2.2 不同来源燕窝中多元素差异分布原因分析

2.2.1 产地 本研究仅对燕窝的2个主要产地印度尼西亚和马来西亚进行研究。根据Shapiro-Wilk检验和Leneve齐质性检验结果，不同产地燕窝中仅Pt呈正态分布且方差齐性，其他元素呈非正态分布，因此以产地为分组变量分别采用t-检验和Mann-Whitney U检验对不同产地燕窝中Pt及其他26种元素的差异显著性进行分析。在燕窝产地间具有显著性差异的9个元素中，印度尼西亚燕窝中的Al、V、Mo、Ba、Co等元素显著高于马来西亚燕窝，而马来西亚燕窝中的Mg、Pt、Ca、Lu等元素则显著高于印度尼西亚燕窝(表2)。根据Spearman相关分析结果，燕盏中Pt、Al、Mg、Mo等元素与产地的相关系数相对较高(≥0.4)，说明这4种元素与产地的关联程度是相对紧密的。

表1 燕窝中27种元素分布情况†

† Pt元素以平均值±标准差表示，其他的元素均以中位数(Q1，Q3)表示；数据取舍原则：≥1 000的数据按照四舍五入原则保留整数部分，介于1与1 000之间的数据按照四舍五入原则取4位有效数字，<1的数据保留小数点后4位。

2.2.2 采收方式 燕窝的采收方式包括从人造燕屋采摘和从天然洞穴采摘2种，采自燕屋称为屋燕，采自天然山洞的称为洞燕[23]。根据Shapiro-Wilk检验和Leneve齐质性检验结果，屋燕和洞燕中仅Pt呈正态分布且方差齐性，其他元素呈非正态分布，因此以采收方式为分组变量分别采用t-检验和Mann-Whitney U检验对不同产地燕窝中Pt及其他26种元素的差异显著性进行分析。结果显示，屋燕和洞燕中的Rb、Cs、Tb元素含量没有显著差别，因此本研究挖掘了24种不同采收方式燕窝间具有显著差异的元素(表3)，其中：洞燕中的B、Mg、Al、P、K、Ca、V、Cr、Mn、Fe、Co、Zn、Sr、Mo、Ba、La、Ce、Nd、Pb等元素的含量显著高于屋燕；屋燕中的Na、Cu、Se、Lu、Pt等元素的含量则显著高于洞燕。天然山洞中可能含有较多的浸矿细菌如硫杆菌属细菌、氧化亚铁铁杆菌、氧化亚铁微螺杆菌等[24]，繁殖的过程中产生了酸等将天然山洞岩壁中的矿质元素浸提出来，金丝燕将燕窝筑在浸出元素的岩壁上，从而导致洞燕中含有多种含量较高的元素。Seow等[19]对比了屋燕与洞燕中K、Ca、Na、Mg的含量，在洞燕中发现较高含量的Ca，在屋燕中也发现了较高含量的Na，与本研究的结果一致。同时，本研究发现洞燕中的3个轻稀土元素La、Ce、Nd的含量也显著高于屋燕。这些轻稀土可能被森林植被富集或过度富集进入到爪哇金丝燕的食物链[25]，经由昆虫榕小蜂、飞蚁和蜉蝣等昆虫进入到爪哇金丝燕体内[26]。

2.2.3 产地×采收方式交互作用 对于离散型数据，首先将除Pt外的其他26个元素按照Tukey法计算正态得分后进行排序，然后采用一般线性模型进行全因子分析对个案排秩后的数据进行分析，分别对产地与采收方式2个主效应及二者的交互作用对不同来源燕窝中元素分布的影响因素进行探索。根据燕窝中元素分布的全因子分析结果(表4)，Se和Pb的校正模型不显著，不能考察产地×采收方式交互作用对二者的影响。为了避免因多次比较造成一类错误概率的增加，在本研究中将显著性水平0.05除以因变量的数目27即为0.001，也就是说只有P<0.001才认为差异是显著的。在此水平下：燕窝中B、Na、P、Ca、Mn、Cu、Sr、Mo、Ba、Nd等10个元素只受采收方式主效应的影响，与产地无关，Seow等[19]与也认为Ca和Na与燕窝的采收方式密切相关；Mg、Al、Zn、Lu、Pt等同时受产地和采收方式主效应的影响，但交互作用的影响不显著。对于受产地×采收方式交互作用显著影响的元素K、V、Cr、Co、Cs、La、Ce来说，除了Cs以外，其他6个元素同时还受采收方式主效应的显著影响，也就是说采收方式对这6个元素在燕窝中分布的影响在2个产地间是不同的。但是，燕窝中的Fe、Rb、Tb既不受主效应的显著影响又不受交互作用的显著影响。由判决系数可知，产地、采收方式以及二者的交互作用能够解释各自变异40%的只有Sr、V、Ca、Na、Pt、Al、Mg 7个元素，即其他元素至少有60%以上的变异是由其他因素造成的，可能包括金丝燕的食物来源、生存环境以及样品收集过程等因素。

表2 不同产地燕窝间显著性差异元素†

† Pt以“均值±标准差”表示，其他的元素均以“中位数(四分位数间距)”表示；*表示2个产地燕窝中的该元素含量存在显著性差异(P<0.05)，**表示2个产地燕窝中的该元素的含量存在极显著性差异(P<0.01)。

表3 不同采收方式燕窝间显著性差异元素†

† Pt和Mg以“均值±标准差”表示，其他的元素均以“中位数(四分位数间距)”表示；*表示2个产地燕窝中的该元素含量存在显著性差异(P<0.05)，**表示2个产地燕窝中的该元素的含量存在极显著性差异(P<0.01)。

3 结论

燕窝中含有丰富的矿质元素和痕量的稀土元素，且绝大多数元素呈偏态分布、变异系数较大。从产地和采收方式以及二者的交互作用等方面对不同来源燕窝中多元素差异分布的原因进行分析，筛选出马来西亚和印度尼西亚产的燕窝间具有显著差异的Mg、Al、Pt等元素，以及屋燕和洞燕间具有显著差异的B、Na、P、Ca、Mn、Cu、Sr、Mo、Ba、Nd等元素。由此可知，基于多元素分析的燕窝产地及采收方式溯源是可行的。为此，在后续的研究中，将利用化学计量学技术基于差异多元素构建燕窝产地及采收方式溯源模型，并收集更多的不同来源燕窝样品以检验模型的预测准确性，解决燕窝的溯源问题，为燕窝真伪鉴别技术体系的构建提供技术储备。

表4 燕窝中元素分布的全因子分析

诚挚感谢中国城市农贸中心联合会燕窝市场专业委员会和中国检验检疫科学研究院HACCP中心的孙利副研究员在燕窝样品收集方面给予的莫大帮助。