断节参的HPLC指纹图谱研究

黄 平，毛坤军＊，周慧云，张 莉，周兴卓

（1. 江西医学高等专科学校药学系 上饶 334000；2. 青岛大学附属医院 青岛 266000）

断节参系萝藦科（Asclepiadaceae）鹅绒藤属（Cynanchum Linn）植物昆明杯冠藤Cynanchum wallichii Wight 的根，又名青洋参，对节参。主要分布于我国四川、云南、贵州以及广西等地。具有补肝肾、强筋骨之功效，主要用于治疗风湿关节炎及肾虚腰痛、病后体虚、跌打损伤等[1]。当前，断节参的药用主要作为著名成药“虎力散”的组成药，其他药用更多凭借的是民间长期药用经验。

为进一步开发利用断节参药材，本课题组前期对断节参根的化学成分进行了系统研究，从中分离得到系列C21甾体苷类化合物和苯乙酮类化合物[2]，并建立了断节参中5 个苯乙酮类化合物的HPLC 含量测定方法[3]，初步建立了断节参的质量控制方法。但随着中药质量标准的逐步提高和规范，2010 版《中国药典》编制大纲中提出中药质量标准应“逐步由单一指标性成分定性定量测定，向活性、有效成分及生物测定的综合检测过渡，向多成分和指纹或特征图谱整体质量控制模式转化”的指导思想[4]，因此，进一步研究断节参药材的HPLC对其质量控制具有重要意义。

本文对采自云南、贵州、广西3个产地的断节参药材进行了HPLC 指纹图谱研究，建立了分离度、重现性均较好的HPLC 指纹图谱方法，为建立全面、整体的断节参药材质量控制方法提供了依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters2695高效液相色谱仪：包括waters e2489检测器，Empower3 工作站（美国Waters 公司）；CPA225D型电子天平（德国赛多利斯）；KQ-500DE 型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；纯水仪（易普易达科技有限公司）；《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件2012版（国家药典委员会）。

1.2 试药

对照品：2,5-二羟基苯甲酸甲酯、白首乌二苯酮、2,4-二羟基苯乙酮为实验室自制，经HPLC 分析纯度均大于98%；断节参药材（S1：云南120914；S2：云南110723；S3：云南131212；S4：云南140726；S5：广西140309；S6：广西121220；S7：贵州131102；S8：贵州140924；S9：贵州130812）；色谱甲醇购自Merck 公司；磷酸、分析甲醇为北京化工产品；水为去离子水。

表1 洗脱程序

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Hanbon-C18色谱柱（4.6 mm × 250 mm，5 µm）；流动相A：甲醇，流动相B：0.5%乙酸水溶液；流速1.0 mL·min-1；柱温30℃；检测波长为265 nm；进样量10µL。梯度洗脱程序见表1。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备

精密称取2,5-二羟基苯甲酸甲酯、白首乌二苯酮、2,4-二羟基苯乙酮对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为96.4、80.3、68.1µg·mL-1的混合对照品溶液，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备

取断节参根药材，粉碎，过筛，称取1.0 g，置50 mL三角瓶中，精密量取甲醇25 mL，称重，超声处理30 min，称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度实验

取批号121220的断节参药材，按“2.2.2”的方法制备供试品溶液，按“2.1”的色谱条件检测。连续进样6次，记录色谱图。以2,5-二羟基苯甲酸甲酯为参照峰，计算出16 个共有色谱峰的相对保留时间RSD 值＜0.5%，相对峰面积的RSD 值＜1.8%，表明仪器的精密度良好。

2.3.2 重复性实验

取批号121220 的断节参药材6 份，按“2.2.2”的方法制备供试品溶液，按“2.1”的色谱条件检测。以2,5-二羟基苯甲酸甲酯为参照峰，计算出16个共有色谱峰的相对保留时间RSD 值＜1.0%，相对峰面积的RSD值＜2.5%，表明本方法的重复性良好。

2.3.3 稳定性实验

取批号121220的断节参药材，按“2.2.2”的方法制备供试品溶液，按“2.1”的色谱条件分别在0、2、4、8、12、24 h检测，记录色谱图。以2,5-二羟基苯甲酸甲酯为参照峰，计算出16 个共有色谱峰的相对保留时间RSD 值＜1.6%，相对峰面积的RSD 值＜1.9%，表明本方法的稳定性良好。

2.4 HPLC指纹图谱的生成及共有峰的指认

2.4.1 HPLC指纹图谱的生成

取不同批次样品适量，按“2.2.2”的方法制备供试品溶液，按“2.1”的色谱条件检测，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012 版）对9 批样品的HPLC图谱进行分析，结果见图1。结果表明，9 批样品的HPLC 图谱共有特征峰16 个，其中6 号色谱峰的峰形好、分离度高、含量高，选择作为参照峰。

2.4.2 共有峰的指认

取混合对照品溶液和供试品溶液，注入HPLC 分析，结果如图2。结果表明，共有峰中4、6、9 分别指认为2,5-二羟基苯甲酸甲酯、白首乌二苯酮和2,4-二羟基苯乙酮。

2.4.3 相似度与各共有峰相关数据分析

采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）对9 批样品的HPLC 图谱进行比较分析。结果得到9批样品的HPLC图谱相似度均＞0.91，详见表1。

3 讨论

3.1 提取方法的选择

本试验比较了不同提取溶剂（甲醇、乙醇）、提取方法（超声、回流）、提取时间（15、30、60 min）、料液比（1∶10、1∶25、1∶50）。以出峰数、各峰面积大小及分离度为评价指标。结果显示以25 倍量的甲醇为提取溶剂，超声提取30 min时提取效率最佳。

3.2 色谱条件的选择

图1 9批断节参药材的指纹图谱

图2 混合对照品溶液和供试品溶液HPLC分析

据报道，断节参中主要含有C21甾体皂苷和二苯酮类成分[5]，通过全波长扫描，发现在265 nm波长下峰数多、峰型好，故选择265 nm 为检测波长；流动相比较了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-酸水，结果显示在甲醇-酸水条件下，峰型好，基线平，各色谱峰分离度较好。

3.3 参照峰的选择

通过标准品比对指认出6 号峰为白首乌二苯酮，药理活性研究表明，白首乌二苯酮具有神经保护和细胞损伤保护作用[6]，常作为中药及其制剂含量测定的指标性成分[7-9]，本试验图谱中白首乌二苯酮保留时间稳定，峰面积较大，与前后色谱峰分离度较好，故选为参照峰。

断节参药材在《云南省中药材标准》和《红河中草药》中均有记载，但均未建立质量控制方法，鉴于断节参药材与近缘种的隔山消、青阳参等药材相似[10]，且部分主要有效成分种类相同，单一的指标性成分含量测定无法完全鉴别不同药材或者同一药材不同产地之间的差异，容易出现使用混乱现象，影响正常用药的疗效和安全性。本试验建立了简单可行、稳定可靠、专属性强、重复性好的断节参HPLC 指纹图谱基础，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》对9批不同产地药材进行分析，确定了16 个共有峰，指认出2,5-二羟基苯甲酸甲酯、白首乌二苯酮、2,4-二羟基苯乙酮3个特征峰，相似度＞0.91。所建立的HPLC 指纹图谱可以结合含量测定，进一步提高和完善断节参药材的质量控制方法。