生产工艺对蜂蜜酒中组胺和酪胺形成的影响

杨晓满，杨晓婷，赵可及，李加友，于建兴

(嘉兴学院 生物与化学工程学院，浙江 嘉兴 314001)

生物胺是一类具有生物活性、含氨基的低分子质量有机化合物的总称，包括腐胺、尸胺、精胺、亚精胺、酪胺、苯乙胺、组胺、色胺等[1]，广泛存在于食品中，过量的生物胺会使人体中毒，引起头疼、血压变化、呼吸紊乱、心悸、呕吐等严重反应[2]，其中组胺和酪胺的生物毒性最大，控制食品中组胺和酪胺的形成是酒类食品的重要安全问题[3]。酿酒过程中原料所含游离氨基酸、可产生氨基酸脱羧酶的微生物以及适合该微生物生长和氨基酸脱羧酶分泌的外界环境都会对最终产品的生物胺含量产生重要影响[4]。在酸性环境中，氨基脱羧酶活性提高，但产生氨基酸脱羧酶细菌的生长会受到抑制，所以pH值对生物胺含量的影响是pH值对氨基脱羧酶和产氨基酸脱羧酶细菌共同作用的结果[5]。温度和酵母菌用量对产氨基酸脱羧酶有显著影响[6-7]。

降低蜂蜜酒中生物胺的含量、提高蜂蜜酒的品质和安全性具有重要意义。本试验通过考察蜂蜜酒酿造中的几个关键因子对组胺和酪胺形成的影响，确定不同工艺条件与组胺和酪胺形成的关系，以优化工艺条件来实现控制蜂蜜酒中生物胺的目的，为蜂蜜酒的开发利用和工业化生产提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

蜂蜜(嘉兴市泌蜜园蜂产品有限公司)；帝伯仕果胶酶(食品级果胶酶，法国进口)；酿酒高活性干酵母(安琪酵母)；柠檬酸和磷酸氢二胺为市售食品级。高氯酸、1，7-二氨基庚烷、丹磺酰氯、NaHCO3、氨水、乙醚均为分析纯；乙腈、丙酮为色谱纯。

VBR90 A手持糖度计(杭州汇尔仪器设备有限公司)，AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)，UB-7 pH计(美国丹佛公司)，戴安U-3000高效液相色谱仪(美国戴安公司)。

1.2 方法

1.2.1 蜂蜜酒的酿造

蜂蜜与水混合均匀→调节糖度→蜂蜜水灭菌(80 ℃)→添加果胶酶(50 ℃)→取干酵母活化(40 ℃)→添加活化的酵母(30 ℃)→装瓶进行蜂蜜酒酿造。

根据前期研究，试验过程将对温度、糖度、pH值、酵母用量等几个因子进行比较，确定其对蜂蜜酒酿造过程中的组胺和酪胺形成的影响。

1.2.2 生物胺含量的测定[8]

样品的衍生。取1 mL待测酒样于15 mL离心管中，加20 mg·L-11，7-二氨基庚烷内标溶液1 mL，加入0.2 mL 2 mol·L-1NaOH溶液使之呈碱性，再加入0.3 mL饱和NaHCO3溶液进行缓冲，然后加入10 mg·mL-1DNS-Cl溶液2 mL进行柱前衍生，在40 ℃水浴黑暗反应45 min，反应结束后加入0.1 mL氨水终止反应，静置30 min。

萃取。加入3 mL乙醚于以上试样中，再加入适量NaCl，振荡分层后抽取上层液体于15 mL离心管中，重复3次，将3次取出的上层液体合并于小烧瓶中，加入适量无水硫酸钠。在100 r·min-1的R-1001旋转蒸发仪上，蒸干得固体颗粒。取下小烧瓶，加入1 mL乙腈振荡清洗，倒出清洗液体，重复3次，合并液体，过0.22 μm微孔滤膜，滤液可直接进HPLC测定。

高效液相色谱分析。采用戴安U-3000高效液相色谱仪，其中色谱柱C18柱(4.6 mm×250 mm内径，5 μm，Acclaim 120)，紫外检测波长230 nm，进样量为20 μL，柱温30 ℃，流动相B为超纯水，C为乙腈溶液，流速1.0 mL·min-1，时间控制在30 min。梯度洗脱程序见表1。

表1 液相色谱的洗脱条件

2 结果与分析

2.1 酿造温度对蜂蜜酒中组胺和酪胺形成的影响

酿造温度对蜂蜜酒的品质有重要的影响，一般酿造温度在18～25 ℃。图1～2可以看出，随着酿造温度的升高，蜂蜜酒中组胺和酪胺的含量显著增加，温度越高则增加越多。可能是酿造温度越高，酵母及其他微生物在醪液中的生长代谢速度越快的原因。在第7天时，酿造温度为22 ℃和24 ℃条件下的组胺含量明显高于其他温度，同时发酵温度越高，酵母的自溶速度也快，引起发酵液中氨基酸含量升高。酒液中组胺的终浓度受温度的影响并不显著，而酪胺的终浓度受酿造温度的影响非常明显。24 ℃时的酪胺浓度高达11.23 mg·L-1，是18 ℃时酪胺浓度(5.55 mg·L-1)的2倍。可见采用低温酿造有利于控制蜂蜜酒中组胺和酪胺的形成。

图1 温度对蜂蜜中组胺形成的影响

图2 温度对蜂蜜中酪胺形成的影响

2.2 糖度对蜂蜜酒中组胺和酪胺形成的影响

蜂蜜酒酿造过程中的主要营养物来源于添加的蜂蜜，通过控制蜂蜜的用量，调整蜂蜜酒酿造中醪液的糖度和其他营养物的浓度。蜂蜜用量过低，所生产的蜂蜜酒酒体单薄，因而适量蜂蜜用量是蜂蜜酒品质的关键控制因素之一[9]。

图3～4表明，糖度对蜂蜜酒中组胺和酪胺的形成有显著影响，当醪液的糖度为30%(Brix)时，组胺和酪胺含量高达3.48和13.01 mg·L-1，分别为低糖度(21%)时的2.8和2.0倍。因此，综合平衡蜂蜜酒的口感和生物胺含量，选择适当浓度的糖度对产品质量至关重要。

图3 糖度对蜂蜜中组胺形成的影响

图4 糖度对蜂蜜中酪胺形成的影响

2.3 pH值对蜂蜜酒中组胺和酪胺形成的影响

pH值是影响食品中生物胺生成重要的发酵条件。酸性环境有利于氨基脱羧酶活性的提高，但会抑制产氨基酸脱羧酶细菌的生长，pH值对生物胺含量的影响是对氨基脱羧酶和产氨基酸脱羧酶细菌共同作用的结果[10]。

图5～6表明，从所考察的pH值(3.3～3.9)对组胺和酪胺形成的影响来看，低pH时，组胺和酪胺含量高；高pH值时，组胺和酪胺含量低。醪液起始pH值3.0时，组胺和酪胺的最高值均超过起始pH值3.9的2倍，但醪液起始pH值超过3.5时，通常会有发酵污染的危险；pH值3.0的醪液对杂菌的生长有抑制作用，采用高pH值生产工艺时，需保证良好的生产环境卫生。

图5 pH值对蜂蜜中组胺形成的影响

图6 pH值对蜂蜜中酪胺形成的影响

2.4 酵母用量对蜂蜜酒中组胺和酪胺形成的影响

酵母在酒精发酵过程中会改变蜂蜜水中含氮化合物的组成，可利用某些氨基酸，也能通过酵母的自溶作用释放一些氨基酸，被乳酸菌等具有氨基酸脱羧酶活性的微生物利用生产生物胺。增加酵母菌的使用量会加快酒精发酵速度，缩短酿造时间，但酵母菌也会产生更多的氨基酸，增加生物胺产生的危险性。

由图7～8可知，不同酵母菌用量的蜂蜜酒中组胺和酪胺生成量有显著区别。当酵母用量为0.20%时，酒中组胺的量明显比其他处理要高；当酵母用量达到0.25%时，组胺的量又显著下降。在考察的酵母用量范围内，随着酵母用量的增加，酪胺的含量同步增加。当酵母用量为0.25%时，酪胺含量为13.23 mg·L-1；而酵母用量为0.10%时，酪胺含量只有8.32 mg·L-1。

图7 酵母用量对蜂蜜酒中组胺形成的影响

图8 酵母用量对蜂蜜酒中酪胺形成的影响

3 小结

通过单因素分析法研究了蜂蜜酒生产过程中温度、糖度、pH值、酵母量等主要工艺参数对组胺和酪胺产生量的影响。不同处理条件下的结果表明，起始阶段组胺的含量先高后低，可能是因为菌体生长旺盛，代谢速度过快造成的。而酿造28 d后，蜂蜜酒中的组胺和酪胺的含量趋于稳定，增量不明显，可能是因为酿造后期的营养物消耗和酒精度过高的双重作用使酒液中的生物转化作用变弱，氨基酸脱羧酶的活力受到严重影响造成的。不同处理条件下的组胺和酪胺的变化趋势并不完全相同，表明蜂蜜酒酿造过程中组胺和酪胺产生的机理有所不同。研究结果表明，不同蜂蜜酒酿造工艺会导致组胺和酪胺产生量的不同。当醪液起始pH值较高、酵母用量较少、糖度和酿造温度均较低时，组胺和酪胺的含量处于较低水平。