高效液相色谱法测定消癌平片中通关藤苷G含量*

王祁民 ，李亚静 ，2，安 静 ，孟 璐 ，2，马银玲

（1.河北省人民医院药学部，河北 石家庄 050051； 2.河北医科大学研究生学院，河北 石家庄 050017）

消癌平片由摩罗科植物通关藤（乌骨藤）干燥藤茎水提后经现代工艺制得，具有抗癌、消炎、平喘作用，目前临床主要用于治疗肝癌、肺癌、食管癌等恶性肿瘤[1-6]。消癌平片药品质量标准含量测定仅以绿原酸一种成分为指标[7]，但绿原酸存在于多种中药中，特异性不强。通关藤及消癌平中主要活性成分均为C21甾体皂苷类物质（包括通关藤苷G）[8-9]。本试验中采用高效液相色谱（HPLC）法测定消癌平片中通关藤苷G含量，为消癌平片的质量控制提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 2695型高效液相色谱仪，配备有2487型紫外检测器（美国Waters公司）；AB204-S型电子分析天平（瑞士Mettler Toledo仪器有限公司）；KQ3200型超声波清洗器（昆山超声仪器厂有限公司）。

1.2 试药

通关藤苷G对照品（北京北纳创联生物技术研究院，批号为160104，纯度大于98%）；消癌平片（烟台东诚大洋制药有限公司，批号分别为 20150301，20150611，20160114，规格为每片0.3 g）；甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Symmetry C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（55∶45，V/V）；检测波长：230 nm；流速：1 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：20 μL。

2.2 溶液制备

供试品溶液：取消癌平片，去除糖衣，研细，取0.55g，精密称定，置分液漏斗中，加入三氯甲烷6 mL、水24 mL，摇匀，静置，取有机层，连续萃取3次，将所制得溶液蒸干，用甲醇复溶，并定容至10 mL，经0.22 μm微膜滤过，取续滤液，即得。

对照品溶液：称取通关藤苷G对照品13.4 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得通关藤苷G质量浓度为1.34 mg/mL的对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性考察：取2.2项下对照品溶液适量，用甲醇稀释，制成通关藤苷G质量浓度为67 μg/mL的对照品溶液。按拟订色谱条件进样对照品溶液、供试品溶液及阴性对照品（甲醇）溶液进行分析，色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察：精密量取2.2项下对照品溶液，用甲醇稀释成系列质量浓度（2，4，8，20，40，60，80，100μg/mL）的对照品溶液，按拟订色谱条件进样分析，记录色谱图。以通关藤苷G色谱峰面积（Y）为纵坐标、质量浓度（X）为横坐标进行线性回归，得回归方程Y=5×106X-6 048，r=0.999 5（n=8）。结果表明，通关藤苷 G 质量浓度在2～100 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取2.2项下对照品溶液适量，加甲醇制成通关藤苷 G低、中、高质量浓度（20.0，40.0，60.0 μg/mL）的对照品溶液，各分别重复进样6次，记录峰面积。结果的RSD分别为0.76%，1.71%，1.27%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：室温下取供试品（样品批号为20150301）溶液，分别于 0，1，3，6，9，12，24 h 时进样测定，记录峰面积。结果的RSD为0.82%（n=7），表明室温下供试品溶液在24 h内稳定。

重复性试验：取同批（批号为20150301）样品粉末，6份，按2.2项下方法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定。结果的RSD为1.84%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：称取样品粉末300 mg，9份，精密称定，分别加入对照品适量，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，计算回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n=9）

2.4 样品含量测定

取3批次样品，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，计算含量。结果批号为 20150301，20150611，20160114的消癌平片中通关藤苷G含量分别为每片 39.8，39.4，40.1 μg。

3 讨论

3.1 检测方法选择

全波长扫描显示，通关藤苷G最大吸收波长为230nm，以此确定230 nm为本试验检测波长。预试验中流动相曾采用乙腈-水等度洗脱，通关藤苷G分离度较差；选用乙腈-0.1%磷酸溶液（55∶45，V/V）为流动相时通关藤苷G峰与相邻峰分离好，基线稳定，最终采用乙腈 -0.1%磷酸溶液（55 ∶45，V/V）洗脱。

3.2 质量控制指标选择

通关藤及其制剂消癌平中成分较复杂，含有C21甾体苷类化合物、三萜皂苷类化合物、多糖类化合物、酚酸类化合物、生物碱类化合物、甾醇/环醇类化合物、挥发油等化学成分[8-9]。前些年的文献多报道其酚酸类成分，徐佳佳等[10]、刘峰群等[11]、潘成学等[12]曾报道通关藤及消癌平中绿原酸等酚酸含量。绿原酸在忍冬科忍冬属、菊科蒿属等植物（如菊花、杜仲、咖啡、金银花等）中含量都非常高。此外，一些水果和蔬菜（如菠菜、马铃薯、胡萝卜等）中也含有绿原酸等酚酸成分。随着研究的深入，学者发现通关藤及消癌平抗肿瘤主要活性成分为其中C21甾体苷类化合物[8-9]，如通关藤苷、通光素等。目前从通关藤中鉴定分离的C21甾体苷有50多种[13]，通关藤苷对人胃癌细胞SGC-7901、小鼠移植S180细胞、小鼠移植P388细胞有显著的体内抑制作用[14]；对人宫颈腺癌荷瘤裸鼠的肿瘤生长增殖均有抑制作用[15]；可抑制肝癌细胞增殖，减少甲胎蛋白分泌[16]；对对乙酰氨基酚诱导的肝损伤有一定保护作用，其机制可能与其减少自由基产生、提高抗氧化物酶活性有关[17]；对CCl4诱导的肝纤维化模型大鼠有显著的保护作用，其机制可能与抗氧化及抑制TGF-β1/Smad信号通路相关[18]。有必要建立以通关藤苷为指标的消癌平片质量控制方法，本研究中在药典和国家质量标准基础上，选择了成分较明确且含量较高的通关藤苷G作为考察指标。

综上所述，本研究中建立的方法简单、可靠，可用于消癌平片的质量控制。